大鼠腦出血周邊組織caspase-3表達(dá)和細(xì)胞凋亡的變化及促紅細(xì)胞生成素的影響

韓 鳳， 李叢言， 關(guān)雪蓮， 侯麗淳， 楊 慧

腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是神經(jīng)科常見病，致殘率和死亡率高，嚴(yán)重地影響著人類健康。目前仍缺少有效的治療手段，出血性腦損傷不僅由于血腫的占位效應(yīng)及血腫對(duì)周邊組織的直接破壞，繼發(fā)性損傷也是出血性腦損傷的主要原因。近期研究認(rèn)為細(xì)胞凋亡是出血性顱腦損傷的重要機(jī)制之一［1］，本研究探討促紅細(xì)胞生成素(EPO)對(duì)大鼠腦出血周邊組織caspase-3表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響，為EPO治療腦出血提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠112只，雌雄不限，體重200～250g，由佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被隨機(jī)分為腦出血組、腦出血+EPO干預(yù)組各56只，兩組分別分為出血前、出血后4h、6h、12h、24h、72h、7d 這 7 個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每時(shí)間點(diǎn)各 8只。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及試劑 原位凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。促紅細(xì)胞生成素購(gòu)自山東阿華生物藥業(yè)有限公司。其它試劑為實(shí)驗(yàn)室常用分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的制備及給藥方法 采用立體定向自體血腦內(nèi)注入法，按照包新民的《大鼠腦立體定位圖譜》［2］進(jìn)行定位，參照牛國(guó)忠［3］報(bào)導(dǎo)的方法及Deinsberger W等［4］的方法改進(jìn)。Wistar大鼠均經(jīng)10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉，大鼠俯臥固定于立體定位儀上，頭頂部剃毛消毒后正中矢狀切開，切口長(zhǎng)約1.5cm，鈍性分離出前囟，在前囟后1mm，右旁4mm處用牙科鉆鉆一直徑約1mm小孔。腦出血組大鼠，距鼠尾末端約2cm處剪斷，取尾血50μl，將微量注射器推進(jìn)至已鉆孔內(nèi)，進(jìn)針5.5mm(相當(dāng)于尾狀核部)后先注入10μl，停針2min后注入剩余40μl血液，2min后退針1.5mm停留7min之后緩慢將針完全退出?？p合皮膚，回籠飼養(yǎng)。腦出血前組只進(jìn)針不注血。腦出血加EPO干預(yù)組與腦出血組前述操作相同，并于術(shù)后即刻、1h、3h、24h、48h、72h 分別腹腔注射 EPO3000U/kg，腦出血組、出血前組注射等量生理鹽水。大鼠清醒后無(wú)偏癱體征，或血液沿針道返流，或血液進(jìn)入腦室者棄用。

1.2.2 caspase-3免疫組織化學(xué)染色 嚴(yán)格按照說(shuō)明書步驟進(jìn)行，在高倍光鏡下(×400)，每張切片計(jì)數(shù)血腫周邊不重疊5個(gè)視野陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值。

1.2.3 凋亡細(xì)胞的原位檢測(cè) TUNEL染色程序按試劑盒內(nèi)的說(shuō)明操作，細(xì)胞計(jì)數(shù)，高倍鏡下(10×40)每片在血腫周邊區(qū)、陽(yáng)性細(xì)胞染色區(qū)隨機(jī)選取2個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野下陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 腦出血周邊組織caspase-3表達(dá)的變化腦出血后4h起，出血周邊腦組織caspase-3表達(dá)明顯增高(P＜0.01)，24h達(dá)高峰，治療組 caspase-3表達(dá)4h起也明顯增高(P＜0.01)，24h達(dá)高峰，治療組各時(shí)間點(diǎn)caspase-3表達(dá)明顯低于腦出血組(P＜0.01)(見表1)。

2.2 腦出血各組凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù) 腦出血后12h起，出血周邊腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增高(P＜0.01)，72h達(dá)高峰，治療組凋亡細(xì)胞數(shù)12h起也明顯增高(P ＜0.01)，72h達(dá)高峰，治療組 12h、24h、72h、7d凋亡細(xì)胞數(shù)明顯低于腦出血組(P＜0.01)(見表2)。

表1 腦出血后不同時(shí)間點(diǎn)caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)表達(dá)的變化(個(gè)，;n=8)

表1 腦出血后不同時(shí)間點(diǎn)caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)表達(dá)的變化(個(gè)，;n=8)

與腦出血前比較*P＜0.05;與腦出血對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較#P＜0.05

組別 腦出血組 EPO組腦出血前腦出血4h腦出血6h腦出血12h腦出血24h腦出血72h腦出血7d 1.23 ±0.39 18.12 ±3.56*30.28 ±3.19*49.25 ±5.32*75.36 ±5.27*58.13 ±4.82*26.17 ±3.45*1.44 ±0.47 16.29 ±4.11*18.12 ±3.98*#29.21 ±3.65*#40.19 ±4.02*#38.29 ±3.68*#16.21 ±2.97*#

表2 腦出血后不同時(shí)間點(diǎn)凋亡細(xì)胞數(shù)變化(;n=8)

表2 腦出血后不同時(shí)間點(diǎn)凋亡細(xì)胞數(shù)變化(;n=8)

與腦出血前比較*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與腦出血對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較#P ＜0.01

TUNEL 數(shù)組別腦出血組 EPO組腦出血前腦出血4h腦出血6h腦出血12h腦出血24h腦出血72h腦出血7d 1.75 ±0.61 1.99 ±0.78 2.28 ±0.60 23.16 ±2.79＊＊93.75 ±5.88＊＊185.30 ±10.53＊＊135.62 ±14.73＊＊1.83 ±0.64 2.14 ±0.68 2.11 ±0.76 18.23 ±1.35＊＊#63.85 ±3.85＊＊#89.98 ±9.67＊＊#61.32 ±3.00＊＊#

3 討論

腦出血是指原發(fā)性非外傷性腦實(shí)質(zhì)內(nèi)出血，是臨床常見病，目前仍沒(méi)有切實(shí)有效的治療手段，出血性腦損傷不僅由于血腫的占位效應(yīng)及血腫對(duì)周邊組織的直接破壞，繼發(fā)性損傷也是出血性腦損傷的主要原因。近期研究認(rèn)為細(xì)胞凋亡機(jī)制參與了腦出血的繼發(fā)性損傷，此機(jī)制為腦出血的防治提供了可能的新手段。神經(jīng)細(xì)胞凋亡是腦出血后致殘的重要原因，因此抑制腦出血周邊組織細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能成為治療腦出血的新靶點(diǎn)。

細(xì)胞凋亡是由各種凋亡刺激信號(hào)始動(dòng)，受細(xì)胞內(nèi)源性基因、酶類和信號(hào)傳導(dǎo)途徑等調(diào)控的“瀑布式”激活過(guò)程。近來(lái)凋亡機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，caspase家族在凋亡過(guò)程中起重要作用，凋亡的最后過(guò)程是通過(guò)caspase的激活而實(shí)現(xiàn)的。細(xì)胞凋亡過(guò)程受多種基因的調(diào)控，caspase是一類天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解酶，而caspase-3是caspase家族中最重要的成員之一，是凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑中重要的調(diào)控基因［5，6］。caspase-3為凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的終末執(zhí)行酶，它的激活是細(xì)胞凋亡的最終共同途徑，caspase-3可以通過(guò)裂解DNA修復(fù)蛋白或者直接破壞蛋白質(zhì)、核酸和胞膜的結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞發(fā)生凋亡。正常情況下caspase酶原沒(méi)有活性，必須通過(guò)激活，才能誘導(dǎo)凋亡。出血后啟動(dòng)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵因素還沒(méi)有確定。有作者認(rèn)為腦出血的鄰近組織受輕微缺血影響［7］，大量激活的血液成分在出血后涌入大腦，其中細(xì)胞因子被活化后可導(dǎo)致信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)凋亡［8］。促紅細(xì)胞生成素是一種主要產(chǎn)生于腎臟的細(xì)胞因子，主要用于治療貧血，EPO在缺血性腦血管疾病病理過(guò)程中具有保護(hù)作用。

EPO是一種多功能營(yíng)養(yǎng)因子及神經(jīng)保護(hù)因子，功能性的EPO受體在多種組織和器官中都有表達(dá)。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)應(yīng)用EPO能減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，對(duì)缺血性腦損傷有保護(hù)作用［9～11］。外源性的EPO在腦缺血損傷下可以透過(guò)血腦屏障對(duì)抗缺血后的神經(jīng)凋亡起到腦保護(hù)作用［12，13］。EPO 對(duì)腦出血的研究目前尚少報(bào)導(dǎo)。

本研究采用分組、藥物干預(yù)及多時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)caspase-3及凋亡細(xì)胞來(lái)探討EPO對(duì)腦出血的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大鼠腦出血后，大鼠腦出血周邊組織caspase-3表達(dá)4h開始升高(P＜0.01)，大約24h左右caspase-3表達(dá)達(dá)峰值。大鼠腦出血周邊組織6h出現(xiàn)凋亡細(xì)胞，12h上升顯著(P＜0.01)，3d凋亡細(xì)胞達(dá)峰值，7d時(shí)仍存在較多凋亡細(xì)胞。EPO干預(yù)后，caspase-3表達(dá)及凋亡細(xì)胞與腦出血組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較顯著下降(P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)提示EPO能抑制caspase-3在腦出血后的表達(dá)，提示EPO通過(guò)抑制caspase-3的表達(dá)，抑制了腦出血后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，減少受損神經(jīng)細(xì)胞的死亡，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞損傷后的恢復(fù)與存活，改善腦出血的預(yù)后，對(duì)腦出血后腦損傷有保護(hù)作用。

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