p38 MAPK在大鼠腦缺血再灌注腦組織AQP4表達(dá)變化及腦水腫形成中的作用

王耀輝， 李國(guó)輝

腦缺血再灌注后腦水腫是缺血性腦卒中重要的病理過(guò)程，同時(shí)也是治療缺血性腦卒中的關(guān)鍵，然而目前對(duì)腦缺血再灌注后腦水腫發(fā)生機(jī)制尚不完全清楚。水通道蛋白4(AQP4)廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在腦水腫的病理生理變化中發(fā)揮著重要的作用［1］。絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路是生物體內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，參與介導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分裂和分化等多種病理生理過(guò)程［2］。作為MAPK家族的一員，p38可在多種(缺血再灌注損傷、滲透壓變化和生理應(yīng)激等)病理生理?xiàng)l件下激活［3］，是腦組織損傷等病理改變的重要信號(hào)通路［4］。研究顯示［5］，在液壓沖擊模型阻中，通過(guò)抑制p38磷酸化，可以降低星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4的表達(dá)及細(xì)胞水腫程度。但p38 MAPK是否在腦缺血再灌注后腦組織AQP4表達(dá)及腦水腫形成中也發(fā)揮作用，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在觀(guān)察大鼠腦缺血再灌注后腦組織磷酸化p38(p-p38)的水平，抑制p38的激活能否降低此過(guò)程腦組織AQP4的過(guò)表達(dá)及腦水腫程度，探討其作用的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要藥品和試劑 兔抗大鼠p38多克隆抗體、p-p38多克隆抗體及AQP4多克隆抗體(Santa Cruz)。羊抗兔IgG(北京中杉金橋)。p38特異性抑制劑SB203580(Selleck)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和給藥 SPF級(jí)雄性SD大鼠54只(體質(zhì)量240～260g)，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):SCXK(桂)2009-0002。隨機(jī)分成3組:假手術(shù)組(sham組，n=18只)、缺血再灌注組(I/R組，n=18只)和p38抑制劑組(SB組，n=18只)。I/R組和SB組分別在制備大腦中動(dòng)脈缺血/再灌注(MCAO/R)模型前15min通過(guò)舌下靜脈注射10%DMSO(400μg/kg)和 p38抑制劑(SB203580，400μg/kg)。各組大鼠均于再灌注24h神經(jīng)癥狀缺損評(píng)分后處死大鼠進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。

1.3 大鼠腦缺血再灌注模型的制備 改良大鼠大腦中動(dòng)脈缺血/再灌注(MCAO/R)模型的制備:腹腔注射10% 水合氯醛(0.30ml/100g)麻醉大鼠，于左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)分叉處分離頸外動(dòng)脈(ECA)及頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)。雙極電凝器凝斷ECA及其分支，游離ECA主干，用眼科剪于ECA的遠(yuǎn)心端斜行45°剪一倒“V”小口并導(dǎo)入栓線(xiàn)。導(dǎo)入深度19～22mm，栓線(xiàn)頭端恰好堵塞大腦中動(dòng)脈(MCA)開(kāi)口。術(shù)后2h拔出栓線(xiàn)，完成MCAO/R模型。假手術(shù)組:不做腦梗死，栓線(xiàn)插入深度＜9mm。若因造模失敗或動(dòng)物死亡等原因?qū)е履硨?shí)驗(yàn)組數(shù)目不足，通過(guò)隨機(jī)抽樣原則補(bǔ)齊動(dòng)物數(shù)目。

1.4 大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分 大鼠腦缺血再灌注24h后，對(duì)其進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。參照Z(yǔ)ea-Longa法［6］:無(wú)神經(jīng)功能缺損癥狀評(píng)0分;對(duì)側(cè)前爪不能完全伸展評(píng)1分;向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈評(píng)2分;向?qū)?cè)傾倒評(píng)3分;不能自發(fā)行走且意識(shí)水平下降評(píng)4分。造模成功的標(biāo)志:大鼠麻醉蘇醒后出現(xiàn)以前肢為重的缺血對(duì)側(cè)肢體的偏癱即神經(jīng)功能缺損評(píng)分1～3分并且斷頭取腦后大腦中動(dòng)脈無(wú)出血或血管內(nèi)血栓形成。

1.5 腦組織含水量測(cè)定 大鼠腦缺血2h再灌注24h，麻醉后快速取腦，將腦組織放在墊有生理鹽水浸濕濾紙的培養(yǎng)皿中。電子天平稱(chēng)濕重，然后將腦組織置于100℃恒溫干燥箱中，烘干24～48h至恒重是為干重。計(jì)算含水量:腦含水量(BWC)=(濕重－干重)/濕重×100%。

1.6 Western blot檢測(cè)腦組織 p-p38、p38 和AQP4的表達(dá) 大鼠腦缺血2h再灌注后24h，麻醉并迅速取腦，于冰上切取缺血周邊區(qū)皮層腦組織，置于液氮中快速冷凍，－70℃保存待用。提取總蛋白后，制備SDS-PAGE凝膠，加樣電泳。濕轉(zhuǎn)法將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，置入封閉液中(5%脫脂奶粉)常溫封閉1h，封閉后加一抗(p38 1∶1000，p-p38 1∶1000，AQP4 1∶300)，4℃孵育過(guò)夜，加入 HRP 標(biāo)記的二抗(羊抗兔 IgG，1∶1000)，37℃孵育1h，ECL 曝光、顯影及定影，以β-actin作為內(nèi)參。光片掃描后用Quantity One軟件分析吸光度，p-p38/p38的吸光度比值A(chǔ)為p-p38的表達(dá)水平，AQP4/β-actin的吸光度比值A(chǔ)為AQP4的表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較采用秩和檢驗(yàn)，其余組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)估 與sham組相比，I/R組、SB組大鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)功能缺損癥狀不同程度加重(P＜0.05)。與I/R組相比，SB組大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀有所改善(P＜0.05)(見(jiàn)表1)。

2.2 腦組織含水量 sham組大鼠腦組織有一定的含水量。與sham組相比，I/R組和SB組大鼠腦組織含水量明顯增加 (P＜0.05);與I/R組相比，SB組大鼠腦組織含水量明顯減少(P＜0.05)(見(jiàn)表1)。

2.3 Western blot結(jié)果 sham組大鼠腦組織中p-p38和AQP4均有少量表達(dá);與sham組相比，I/R組大鼠缺血周邊區(qū)腦組織p-p38的水平明顯上升(P ＜0.05)，AQP4的表達(dá)也明顯上調(diào)(P ＜0.05);與I/R組相比，SB組大鼠缺血周邊區(qū)腦組織p-p38的水平明顯下降(P＜0.05)，AQP4的表達(dá)也明顯下調(diào)(P ＜0.05)(見(jiàn)表2)。

表1 各組大鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)功能評(píng)分及腦含水量(n=6，)

表1 各組大鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)功能評(píng)分及腦含水量(n=6，)

與sham組比較△P＜0.05;與I/R組比較*P＜0.05

組別 神經(jīng)功能評(píng)分 腦含水量sham組I/R組SB組0 2.33 ± 0.16△1.72 ± 0.18*0.776 ± 0.007 0.817 ±0.012△0.792 ±0.010*

表2 各組大鼠腦缺血再灌注后腦組織AQP4和p-p38表達(dá)(n=6，)

表2 各組大鼠腦缺血再灌注后腦組織AQP4和p-p38表達(dá)(n=6，)

與sham組比較△P＜0.05;與I/R組比較*P＜0.05

組別 例數(shù)AQP4 p-p38 sham組I/R組SB組666 1.224 ± 0.144 2.660 ± 0.130△1.771 ± 0.092*0.648 ± 0.096 2.463 ± 0.138△1.653 ± 0.105*

3 討論

腦水腫是缺血性腦卒中重要的繼發(fā)性腦損害，直接影響缺血性腦卒中患者的預(yù)后，是臨床治療腦卒中的關(guān)鍵。所以，如何預(yù)防和治療缺血性腦卒中后腦水腫一直是臨床研究的熱點(diǎn)。

MAPK廣泛分布于細(xì)胞的胞漿內(nèi)，是細(xì)胞各種生物學(xué)反應(yīng)的重要信號(hào)傳導(dǎo)通路，它主要包括:p38、ERK1/2及JNK 3種亞家族成員。p38 MAPK可在多種(缺血再灌注損傷、滲透壓變化和生理應(yīng)激等)條件下激活［3］，并在神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用［7，8］。Wallace 等［9］在大鼠腦缺血性卒中實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭邪l(fā)現(xiàn)，抑制p38的激活可以有效降低腦水腫的程度。Nito等［10］在體外星形膠質(zhì)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，抑制p38的激活可以降低星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4的表達(dá)，減輕星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫的程度。

AQP4是維持腦組織水平衡的主要水通道蛋白，在腦內(nèi)水平衡的調(diào)節(jié)中起到關(guān)鍵作用［11］。研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞毒性腦水腫模型中，敲除AQP4基因的大鼠與野生型大鼠相比，其星形膠質(zhì)細(xì)胞足突腫脹及細(xì)胞毒性腦水腫的程度均明顯減輕［12］，而在A(yíng)QP4基因過(guò)表達(dá)的大鼠細(xì)胞毒性腦水腫模型中，其顱內(nèi)壓較野生型鼠明顯增高［13］。此外，在其他細(xì)胞毒性腦水腫模型研究中［14，15］，也進(jìn)一步證實(shí)AQP4的高表達(dá)與細(xì)胞毒性腦水腫密切相關(guān)。p38 MAPK是否對(duì)大鼠腦缺血再灌注后腦組織中AQP4的表達(dá)及腦水腫的發(fā)生發(fā)展起到關(guān)鍵作用，目前國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)報(bào)道。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腦缺血再灌注后缺血周邊區(qū)腦組織中p-p38的水平明顯增加，AQP4表達(dá)亦增高，腦組織含水量增加，腦水腫程度加重。與腦缺血再灌注大鼠相比，在造模前預(yù)先給予p38特異性抑制劑(SB203580)的大鼠缺血周邊區(qū)腦組織中p38的磷酸化受到明顯抑制，AQP4表達(dá)水平亦降低，腦組織含水量減少，腦水腫程度減輕。我們推斷:由于腦缺血再灌注過(guò)程中p38 MAPK被激活，致使p-p38表達(dá)增高并介導(dǎo)其下游因子AQP4表達(dá)的上調(diào)，導(dǎo)致過(guò)多水分流入細(xì)胞內(nèi)，腦水含量增多，腦水腫程度加重;p38特異性抑制劑抑制可抑制腦缺血再灌注過(guò)程中p38的過(guò)度激活，致使p-p38表達(dá)降低，進(jìn)而有效下調(diào)AQP4的過(guò)表達(dá)，減少過(guò)多的水分流入細(xì)胞內(nèi)，減輕腦水腫。

綜上所述，抑制p38 MAPK在大鼠腦缺血再灌注過(guò)程中的過(guò)度激活，可下調(diào)AQP4的高表達(dá)，減輕腦水腫的程度，說(shuō)明p38 MAPK在調(diào)節(jié)腦缺血再灌注大鼠腦組織中AQP4表達(dá)及腦水腫過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。此研究結(jié)果為腦缺血再灌注后腦水腫的機(jī)制和臨床靶點(diǎn)治療的探索提供了新的線(xiàn)索，但具體的防治措施及分子機(jī)制有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)和研究。

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