大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞相關(guān)基因研究

閆西剛， 貢志剛， 張榮俊， 蘭 青

近年來(lái)對(duì)BMSCs體外誘導(dǎo)分化的研究已經(jīng)取得了極大的進(jìn)展，但有關(guān)分化機(jī)制的許多問(wèn)題仍沒(méi)有解決，特別是有哪些基因參與了誘導(dǎo)分化的調(diào)控，每種基因在調(diào)控中起到何種作用等一系列問(wèn)題仍沒(méi)有得到解決。為了在基因水平上進(jìn)一步研究BMSCs誘導(dǎo)分化的機(jī)制問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)借助Affymetrix基因芯片對(duì)BMSCs分化過(guò)程中的基因表達(dá)情況進(jìn)行研究，試圖找出與神經(jīng)元分化密切相關(guān)的基因，一方面從分子水平驗(yàn)證其向神經(jīng)元分化的能力;另一方面也為BMSCs的基因工程改造提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與材料 動(dòng)物:成年近交系Wistar大鼠(＞36代)，雌雄不限，體質(zhì)量約300克/只(中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。試劑:DMEM(Gibco公司)、F12(Gibco公司)、胎牛血清(FBS，杭州四季青公司)、淋巴細(xì)胞分離液(密度為1.077g/L，上海試劑二廠)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor bFGF，Sigma公司)、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor EGF，Peprotech公司)、山羊血清(PAA公司)、Triton-X-100(Sigma公司)、聯(lián)脒二苯吲哚(DAPI，Sigma公司)、兔抗CD44抗體(武漢博士德生物工程有限公司)、小鼠抗兔CD45單克隆抗體(Caltag公司)、兔抗β-Tubulin III抗體(Corance公司)、兔抗GFAP抗體(DAKO公司)、Alexa Fluor 488標(biāo)記羊抗兔IgG(Molecular Probes公司)、Cy3標(biāo)記羊抗小鼠IgG(Dianova公司)。儀器:CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(ESPEC BNA-311)、倒置相差顯微鏡(XDS-1B)、激光共聚焦顯微鏡(Ziess LSM410);Affymetrix U133 plus 2.0基因表達(dá)譜芯片(上海生物芯片有限公司提供)。

1.2 方法

1.2.1 關(guān)于BMSC BMSC的取材、細(xì)胞培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化及免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定詳見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)告［1］。

1.2.2 總RNA的提取和基因芯片雜交 按Trizol試劑盒說(shuō)明采用一步法從組織樣本中抽提總RNA，RNeasy Mini Kit進(jìn)行純化。抽提的 RNA用1%的DEPC溶解后在紫外分光光度儀下測(cè)定RNA的濃度和純度，同時(shí)凝膠電泳檢測(cè)RNA有無(wú)降解。按Super-ScriptⅡ試劑盒操作說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后用RNA轉(zhuǎn)錄標(biāo)記試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄合成cDNA探針，合成的同時(shí)進(jìn)行生物素標(biāo)記;生物素標(biāo)記的cDNA探針經(jīng)片段化處理后與基因芯片(Affymetrix Rat Expression Array230 2.0)在雜交爐 640中45℃雜交16h，然后于基因芯片流程工作站400中洗脫、染色。最后用GeneArray掃描儀掃描雜交信號(hào)。

1.2.3 芯片數(shù)據(jù)處理 雜交后的芯片經(jīng)Gene array Scanner3000 7G掃描儀讀取數(shù)據(jù)點(diǎn)后計(jì)算得出一個(gè)顯著性P值。采用GCOS軟件比較計(jì)算兩張芯片上同一探針的信號(hào)值得到顯著性差異P值，根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)定義，P值差異在0～0.002之間的，認(rèn)為基因表達(dá)為上調(diào)(Increase I);在0.998 ～0.999 之間的認(rèn)為是表達(dá)下調(diào)(Decrease D);0.003～0.997之間的認(rèn)為該基因的表達(dá)量在所比較的兩張芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果中沒(méi)有變化(No Change NC);位于兩個(gè)區(qū)間0.002～0.003和0.997 ～0.998 內(nèi)的屬于臨界狀態(tài)(Marginal Increase MI;Marginal Decrease MD)。進(jìn)一步結(jié)合另2個(gè)嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)，最終可靠地篩選出上調(diào)(Up)和下調(diào)(Down)基因。上調(diào)(Up)或下調(diào)(Down)需同時(shí)滿足以下3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，上調(diào)(Up):Signal Log Ratio＞ =1，實(shí)驗(yàn)組 Detection為 P，Change為I或 MI;下調(diào)(Down):Signal Log Ratio＜ = －1，對(duì)照組Detection為 P，Change為 D 或 MD(注:Signal是掃描儀檢測(cè)出的光強(qiáng)度經(jīng)過(guò)Normalize后的數(shù)據(jù);Detection分為P、A和M 3種，P代表Present，A代表Absent，M代表Marginal;Signal Log Ratio指實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組比值取Log2后的值)。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs的培養(yǎng)、傳代 原代的BMSCs呈貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，形態(tài)多樣，胞體呈梭形、橢圓形、三角形、不規(guī)則形。傳至第3代時(shí)，細(xì)胞形態(tài)趨于一致，大部分細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞密集生長(zhǎng)處呈現(xiàn)旋渦狀、菊花狀、輻射狀。傳代后的細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，3～4d即可長(zhǎng)滿瓶底。至3代以后，細(xì)胞形態(tài)趨于一致。

2.2 BMSCs免疫表型鑒定 CD44抗原是BMSCs表面標(biāo)志性抗原之一，免疫細(xì)胞化學(xué)熒光染色顯示，BMSCs經(jīng)CD44抗體染色后可見(jiàn)大量呈綠色的CD44陽(yáng)性細(xì)胞。第四代BMSCs的CD44陽(yáng)性率最高為(95.23 ±3.06)%。

2.3 BMSCs的誘導(dǎo)分化 BMSCs誘導(dǎo)72h后，大部分細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變，伸出類似神經(jīng)元樣的突起，突起之間相互連接，形成廣泛的網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)。4d后細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變的趨勢(shì)減緩，7d后幾乎已無(wú)細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變。

2.4 BMSCs誘導(dǎo)分化后的免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定分別對(duì)誘導(dǎo)1～7d的細(xì)胞行幼稚神經(jīng)元標(biāo)記物β-TubulinIII、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP染色，發(fā)現(xiàn)隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)β-TubulinIII陽(yáng)性細(xì)胞以及GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)逐漸增加，至第7天時(shí)達(dá)到最高，分別為(75.43 ±7.63)%和(33.01 ±6.73)%。

2.5 Scatter散點(diǎn)圖 芯片雜交后的掃描圖。其中散點(diǎn)圖的X軸為對(duì)照組的信號(hào)值，Y軸為實(shí)驗(yàn)組的信號(hào)值，圖中紅色的點(diǎn)為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組該基因的Detection均為P，藍(lán)色的為兩組中有一個(gè)值不是P的，而黃色的點(diǎn)為兩組均為A。散點(diǎn)圖中共有8條斜線，它們由上往下為 30、10、3、2、－2、－3、－10、－30，篩選出來(lái)的差異基因應(yīng)該在2和－2線外。

2.6 芯片檢測(cè)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)得到0d，7d兩張基因芯片。在0d和7d的芯片表達(dá)譜中共發(fā)現(xiàn)差異基因97條(本文不具體列出)，其中上調(diào)基因62條，下調(diào)基因35條。通過(guò)文獻(xiàn)檢索，發(fā)現(xiàn)有24條基因與神經(jīng)元發(fā)育相關(guān)，其中經(jīng)誘導(dǎo)后表達(dá)上調(diào)的基因有18條(見(jiàn)表1)，表達(dá)下調(diào)的有6條(見(jiàn)表2)。

表1 BMSCs誘導(dǎo)后表達(dá)上調(diào)的與神經(jīng)元發(fā)育相關(guān)的基因

表2 BMSCs誘導(dǎo)后表達(dá)下調(diào)的與神經(jīng)元發(fā)育相關(guān)的基因

3 討論

BMSCs是存在于骨髓中除造血干細(xì)胞外的另一種干細(xì)胞。近年來(lái)的研究顯示，BMSCs可在體內(nèi)、體外誘導(dǎo)成為神經(jīng)元樣細(xì)胞［2］，并能增殖和具有神經(jīng)細(xì)胞的一些功能，加之其來(lái)源豐富，取材簡(jiǎn)便，易于分離純化培養(yǎng)，在一定條件下可在體外迅速擴(kuò)增，且自體移植克服了倫理和免疫排斥的問(wèn)題［3］，因此有望成為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細(xì)胞替代療法和基因治療的載體［2］。但它同樣也面臨著許多棘手的問(wèn)題。BMSCs定向分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的過(guò)程比較復(fù)雜，其多潛能性決定了它的分化調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜性，如何弄清其分化機(jī)制問(wèn)題，以便我們通過(guò)人工干預(yù)的手段促使其更好的向神經(jīng)元方向分化，是我們亟待解決的問(wèn)題?；蛐酒某霈F(xiàn)為解決這些難題提供了新的思路。本實(shí)驗(yàn)利用基因芯片技術(shù)對(duì)BMSCs分化過(guò)程中的基因表達(dá)譜進(jìn)行分析。通過(guò)分析，我們發(fā)現(xiàn)在0d和7d的芯片表達(dá)譜中共有差異基因97條，其中上調(diào)基因62條，下調(diào)基因35條。這些基因中有24條基因功能相對(duì)單一且與神經(jīng)元發(fā)育密切相關(guān)。我們挑選了部分重要的差異表達(dá)基因，現(xiàn)將這些基因的最新研究以及它們與神經(jīng)元的關(guān)系進(jìn)行簡(jiǎn)單的闡述。

Noggin基因在胚胎發(fā)育和神經(jīng)系統(tǒng)的成熟過(guò)程中起到重要作用，其神經(jīng)誘導(dǎo)功能主要與其對(duì)骨形態(tài)形成蛋白(BMP)的抑制作用有關(guān)［4］。Noggin與BMP2/BMP4的親和性較高，可阻滯BMP2/BMP4與其相應(yīng)的受體結(jié)合，抑制BMPs受體信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的形成。小鼠胚胎干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Noggin與BMP4可調(diào)控胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)元的分化，還可調(diào)控成年神經(jīng)干細(xì)胞的增殖與分化，抑制Noggin基因轉(zhuǎn)錄可降低神經(jīng)干細(xì)胞的增殖［5］。Noggin參與調(diào)節(jié)成年神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞形成和神經(jīng)元形成之間的平衡，調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)和記憶的過(guò)程。這都表明Noggin具有重要的神經(jīng)誘導(dǎo)功能。我們實(shí)驗(yàn)中Noggin在BMSCs誘導(dǎo)分化后高表達(dá)進(jìn)一步證實(shí)了其在BMSCs向神經(jīng)元分化過(guò)程中扮演著很重要的角色。BMP4(bone morphogenetic protein 4，骨形態(tài)形成蛋白)在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的不同時(shí)期、不同部位均起著重要的作用。其在啟動(dòng)BMSCs分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，主要表達(dá)于神經(jīng)前體細(xì)胞，對(duì)神經(jīng)前體細(xì)胞具有誘導(dǎo)其增殖和分化的作用。有報(bào)道表明在干細(xì)胞分化過(guò)程中，BMP4即可以促進(jìn)神經(jīng)元的分化，也可以促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化，其在胚胎發(fā)育第13d天時(shí)促進(jìn)神經(jīng)元的分化，在17d時(shí)促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞的分化［6］。在神經(jīng)元分化的中后期，其促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞分化的功能受到Noggin基因抑制，從而促進(jìn)了BMSCs向神經(jīng)元方向分化。Rtn1基因是漿膜蛋白家族的成員，在具有神經(jīng)內(nèi)分泌性質(zhì)的細(xì)胞中高度表達(dá)，因此被稱為神經(jīng)內(nèi)分泌特異蛋白(neuroendocrine specific protein，NSP)［7］。其已被證實(shí)與神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)分泌密切相關(guān)，其編碼的蛋白質(zhì)-漿膜蛋白對(duì)神經(jīng)元的增殖和分化起到重要的作用。MAP2(microtubule-associatedprotein 2，微管相關(guān)蛋白2)是神經(jīng)元特異性微管相關(guān)蛋白，有穩(wěn)定神經(jīng)元微管和保持神經(jīng)元形態(tài)的作用，是突起胞漿的重要組成部分，位于神經(jīng)元的胞體和樹突，其對(duì)BMSCs誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)的改變及保持神經(jīng)元的功能起到重要作用。此外，MAP2是樹突中主要的PKA(cAMP-dependent protein kinase)錨定蛋白，MAP2缺失，引起大腦皮層及海馬神經(jīng)細(xì)胞樹突中PKA量減少，由于PKA量的減少，PKA底物之一CREB(cAMP-responsive element binding protein)的磷酸化發(fā)生異常，從而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)出現(xiàn)異常。因此，MAP2除了有穩(wěn)定神經(jīng)元微管和保持神經(jīng)元形態(tài)的作用外，在調(diào)節(jié)PKA的量、控制誘導(dǎo)CREB的磷酸化，即神經(jīng)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面也起著重要的作用。Numb基因主要分布在分裂中的神經(jīng)上皮中的頂部皮層，在神經(jīng)上皮皮層垂直分裂的時(shí)候，Numb基因起抑制分化的作用并維持神經(jīng)上皮狀態(tài)［8］，另有研究表明Numb基因?yàn)閰⑴c神經(jīng)干細(xì)胞定向分化過(guò)程的基因之一［9］。本實(shí)驗(yàn)中Numb基因在BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化后表達(dá)下降，這與該基因的分子生物學(xué)特性相符合，BMSCs未分化前大部分細(xì)胞維持干細(xì)胞狀態(tài)，Numb基因高表達(dá)，BMSCs經(jīng)誘導(dǎo)后向成體神經(jīng)元樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化，Numb基因的表達(dá)量有所下降。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)BMSCs誘導(dǎo)分化前后基因表達(dá)譜的分析，發(fā)現(xiàn)了部分與神經(jīng)元分化相關(guān)的差異表達(dá)基因，一方面進(jìn)一步支持了BMSCs可以向神經(jīng)元方向轉(zhuǎn)化的理論;另一方面深化了對(duì)BMSCs向神經(jīng)元分化相關(guān)分子機(jī)制的理解。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中我們將行RT-PCR及Western Blot對(duì)篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證及研究，以便我們通過(guò)人工干預(yù)的手段促使其更好的向神經(jīng)元方向分化，為基因工程改造利用BMSCs奠定扎實(shí)的基礎(chǔ)。

［1］閆西剛，貢志剛，蘭 青，等.大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)及分化的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)微侵襲神經(jīng)外科雜志，2007，12(4):175－178.

［2］邊 穎，何志義.骨髓基質(zhì)細(xì)胞對(duì)大鼠缺血性腦梗死神經(jīng)功能的影響［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志，2010，30(23):3529 －3530.

［3］劉巧云，易 黎.骨髓基質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng)、體外向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化及其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的研究進(jìn)展［J］.神經(jīng)損傷與功能重建，2010，5(2):139 －142.

［4］丁 潔，高 山，程 焱，等.神經(jīng)生長(zhǎng)因子、Noggin基因轉(zhuǎn)染對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的影響［J］.中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2010，9(6):553－557.

［5］孫 鉉，周盛年，張明麗，等.轉(zhuǎn)染Noggin基因的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的研究［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志，2009，29(8):930－933.

［6］Nakajima T，Ota M，Ito K.Differentiation of autonomic neurons by BMP-independent mechanisms［J］.Cell Tissue Res，2009，332(1):25－35.

［7］胡 鵬，謝鼎華，肖自安，等.漿膜蛋白R(shí)NT1和RNT4基因在小鼠內(nèi)耳的表達(dá)［J］.中華耳科學(xué)雜志，2009，3(4):275 －277.

［8］劉琳豐.Numb和Notch蛋白與細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的研究進(jìn)展［J］.國(guó)際移植與血液凈化雜志，2009，6(4):33－36.

［9］許漢鵬，茍 琳，黃文晉，等.Numb基因在培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞中的表達(dá)［J］.中國(guó)臨床康復(fù)，2010，7(19):2678 －2679.