外生菌根菌的分離與培養(yǎng)的研究進展

王 冉，劉朝貴*，須 建

（1.西南大學園藝園林學院，重慶 400715；2.重慶醫(yī)藥高等?？茖W校，重慶 401331）

土壤中某些真菌與植物根能夠形成具有特定功能和形態(tài)的共生體即菌根（Mycorrhiza）[1]，這些真菌被稱為菌根菌。其中真菌菌絲在植物根外形成菌絲套的稱為外生菌根菌（Ectomycorrhizal Fungi），其菌根特征是真菌菌絲伸入根部細胞的間隙，而不深入到細胞內(nèi)，真菌菌絲體緊密地包圍植物幼嫩的根，形成菌套，有的向周圍土壤伸出菌絲，代替根毛的作用。外生菌根菌是溫帶森林生態(tài)系統(tǒng)重要的組成部分，是物質循環(huán)和能量流動過程中的關鍵環(huán)節(jié)，是森林生態(tài)系統(tǒng)進程最活躍的驅動力之一[2]。它與宿主植物形成的外生菌根具有富集養(yǎng)分、幫助宿主植物吸收礦物質、增加對水分的吸收、提高宿主植物免疫能力和改良森林土壤等重要作用[3－5]，這對生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定有著極其重要的意義。中國有極為豐富的外生菌根菌資源，例如傘菌類中的紅菇屬、乳菇屬、鵝膏菌屬、牛肝菌屬以及子囊菌類的塊菌屬等。大多數(shù)外生菌根菌，如松茸、美味牛肝菌、塊菌等還有著極高的食（藥）用價值，是重要的經(jīng)濟種[6，7]。

在生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定、社會經(jīng)濟發(fā)展方面表現(xiàn)出的巨大研究價值使外生菌根菌受到了國內(nèi)外微生物、農(nóng)林業(yè)和食用菌研究人員的廣泛重視。同時鑒于林木濫伐，森林更新樹木品種單一，森林管理方法缺陷等影響外生菌根菌生存的問題的存在[8，9]，使菌根菌在林中的數(shù)量及種類逐漸減少，為保護森林的生態(tài)資源，研究和開發(fā)菌根菌的經(jīng)濟價值成為迫切的目標。外生菌根菌的研究與擴繁首先涉及到的過程是分離與培養(yǎng)。外生菌根菌的分離培養(yǎng)是外生菌根研究和應用的前提與基礎，純菌種的獲得也是實現(xiàn)菌根合成的基礎及簡便的方法。所以通過分離，培養(yǎng)成功獲得菌絲體純培養(yǎng)物無疑會拓展外生菌根菌資源的應用。松茸是一種嚴格的營養(yǎng)共生型外生菌根菌，生態(tài)習性十分特殊，至今尚不能像一般腐生菌那樣在完全人工條件下獲得子實體，故其菌絲體就成為目前人工培養(yǎng)和加工利用的重要形式，迄今已見多種培養(yǎng)基用于松茸[10]。Danell和Camacho[11]獲得了雞油菌菌絲純培養(yǎng)方法，在歐洲赤松上人工合成了菌根，并從該菌根苗上收獲到了幼小的子實體。松乳菇、紅根須腹菌、點柄乳牛肝菌[12，13]等也有純培養(yǎng)成功的例子。但是目前為止仍有許多外生菌根菌沒能分離到菌絲或者菌絲生長特別慢[14-16]，因此能有效促進菌絲體生長的培養(yǎng)條件一直是研究者們所追尋的。本文綜述了菌絲體純培養(yǎng)的一般過程以及迄今為止培養(yǎng)成功的外生菌根菌的關鍵步驟，旨在為未培養(yǎng)成功的外生菌根菌和進一步的研究提供基礎。

1 外生菌根菌的分離

1.1 分離材料的要求

1.1.1 子實體

分離中盡量選擇新鮮健康、無病蟲害的完整子實體，一般傘菌類選擇幼嫩子實體為好。過熟的子實體分離極易污染，或者根本無法萌發(fā)菌絲；剛成熟的子實體不易污染，組織塊可萌發(fā)菌絲體；新鮮未成熟的子實體則較容易分離菌絲體。取其孢子的話，子實體有菌膜的，如紅菇、鵝膏菌等最好選用菌膜將破而未破的；沒有菌膜的可以選取八成熟的、正在釋放孢子的個體。

1.1.2 菌根

應選擇鮮嫩，長勢良好的菌根進行分離。

1.2 分離方法的選擇

外生菌根菌的分離按照分離材料性質不同，主要分為孢子分離法、組織分離法和菌根分離法3種[17，18]。

1.2.1 孢子分離法

孢子分離法指利用真菌所產(chǎn)生的有性孢子（擔孢子或子囊孢子）進行純培養(yǎng)而獲得純種的方法。一般包括單孢分離法和多孢分離法。采用孢子彈射法、褶上涂抹法、勾懸法、貼附法來采集孢子，然后用稀釋培養(yǎng)法分離孢子。孢子萌發(fā)所形成的菌絲體生理年齡小，生活力旺盛，有利于對原菌種的復壯。孢子分離法的缺陷是操作步驟復雜，容易被污染；可能還會因為孢子休眠難以打破而需要花費很長的實驗時間[19，20]，其優(yōu)良種性難以保持；由于孢子個體之間有差異，且自然分化現(xiàn)象較嚴重、變異大，同時要求具有較高的實驗技術。

1.2.2 組織分離法

組織分離法指利用真菌的子實體、菌索或菌核等部分組織作為分離材料獲得純種的方法。它是基于組織化的菌絲體在適宜的條件下可恢復為絨毛狀菌絲生長特性進行的，故其本質屬于無性繁殖。此法所獲得的菌種能保持原有菌種的優(yōu)良性狀，不易發(fā)生變異。該法不僅適合于孢子不易萌發(fā)或不能形成孢子的真菌菌種分離，而且對野外采集到的菇類的菌種分離，也不失為一種行之有效的方法。因此，組織分離法在實踐中被廣泛地應用[18]。

1.2.3 菌根分離法

菌根分離法是指利用外生菌根菌感染的宿主植物膨大的須根作為分離材料獲得純種的方法。國外常用此法來獲得菌絲體[21-23]。從菌根中分離菌絲體的主要問題是必須確保菌根處于無污染狀態(tài)，過去的菌根培養(yǎng)常常將其它污染物誤以為是所需的真菌。

在這3種分離方法中，有關外生菌根菌孢子分離法與菌根分離法的報道比較少，而且由于實驗技術要求高，在國內(nèi)鮮有研究人員用這兩種方法來獲取純菌種。組織分離法作為應用最為廣泛也是最為簡便的方法，可以作為外生菌根菌分離方法的首選。本文綜述的分離過程即為組織分離。

1.3 分離部位的選擇

分離成功與否與所取部位的菌絲組織的結構和類型有關。一般傘菌類的子實體，分離菌蓋和菌柄連接處的菌肉組織較好[24，25]，由于菌柄內(nèi)組織高度分化，再生能力較差，不易分離成功；對于菌褶來說，有內(nèi)或外菌幕保護的話，可以取菌幕保護下的幼嫩菌褶接種；如果是暴露于空氣中的話，則很容易被雜菌污染，即使是幼嫩的組織也不易分離成功。但是對于紅菇科真菌，因其菌肉主要由已經(jīng)失去分生能力的泡囊菌絲組成，很難分離成功，應選擇其菌柄內(nèi)側接近外表皮處的非泡囊菌絲進行分離。對于塊菌目真菌，分離未成熟的造孢組織，比較容易獲得成功。

1.4 分離過程的注意事項

1.4.1 分離材料的處理

據(jù)食用菌有關資料報道，對于較大易吸水的子實體，分離時不宜用藥劑表面消毒和無菌水沖洗，也不用滅菌刀片切開組織，以免水分浸入及刀片對子實體內(nèi)部的燙傷或污染?？芍苯硬捎猛绞址蛛x法，再迅速用滅過菌的鑷子或解剖刀挑取米粒大小的組織塊于培養(yǎng)基上，分離效果十分理想，且方便、簡捷且高效[26]。其它子實體可先用無菌水沖洗干凈（如塊菌），可在沖洗時用小軟刷輕刷表面，然后用無菌濾紙吸水，再用75%的酒精或0.1%的升汞進行簡單的表面消毒（為保持組織塊中孢子菌絲活力不宜對其進行滅菌[27]），最后在超凈工作臺中徒手分離子實體后接種。

1.4.2 實驗容器的選擇

培養(yǎng)皿（與試管比）雖具有可供菌絲生長的較大面積和開口大易將組織塊接入等特點，但對無菌操作技術也有較高的要求，否則易被雜菌污染；試管（與培養(yǎng)皿、三角瓶、小廣口瓶比）口小，污染少，但管口小，接種過程中組織塊不易接入導致燙傷甚至燙死，出現(xiàn)萌發(fā)率低，再則表面積小，不宜與雜菌分離；三角瓶和小廣口瓶兼有培養(yǎng)皿和試管二者的優(yōu)點，即瓶口較培養(yǎng)皿小、較試管大，組織塊較易接入又不被燙傷和污染?？晒┚z生長的面積大于試管而小于培養(yǎng)皿，能使菌絲充分擴展生長，滿足了菌種分離的條件要求，達到分離目的[28]。

2 外生菌根菌菌絲體的培養(yǎng)

2.1 培養(yǎng)基的選擇

對外生菌根菌純培養(yǎng)的研究首先要討論的是培養(yǎng)基。關于外生菌根菌培養(yǎng)基種類的選擇有不同的觀點。欒慶書等[29]指出培養(yǎng)外生菌根菌的培養(yǎng)基常用的有天然培養(yǎng)基，如PDA、PDMA；半組合培養(yǎng)基HM、MMN、CPAD、CMA等；組合培養(yǎng)基MRD、MMA等。有的學者認為，天然基質組成的培養(yǎng)基，因其含有淀粉和豐富的維生素比人工合成的培養(yǎng)基更有利于外生菌根菌的生長；也有學者認為外生菌根菌在生長過程中分泌胞外酶的能力較弱，對天然培養(yǎng)基中的大分子營養(yǎng)物質利用較差，而較易利用合成培養(yǎng)基中的小分子營養(yǎng)物質，因此在合成培養(yǎng)基上長勢較好[30]。

王曉光[31]等的實驗表明松茸菌絲體在改良的MMN、改良的菌根菌分離用培養(yǎng)基、改良的PDA培養(yǎng)基中，菌絲生長速度最為旺盛；于富強[24]等對13科、19屬、33種真菌進行了菌根真菌分離培養(yǎng)研究，發(fā)現(xiàn)修改的PDA培養(yǎng)基和松針、玉米培養(yǎng)基分離成功率較高，適用于多數(shù)菌種的分離、培養(yǎng)，是比較理想的菌根真菌分離培養(yǎng)基；Lotti M.[32]等對黑孢塊菌、冬塊菌、斑點塊菌等多種塊菌進行菌絲體的分離培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)WPM培養(yǎng)基是最有效的培養(yǎng)基；黃光文[33]等首次報道了外生菌根菌的共生培養(yǎng)法，初步研究了一個較好的外生菌根菌菌絲體培養(yǎng)方法，即將宿主的愈傷組織與外生菌根共同培養(yǎng)，可以明顯地促進真菌菌絲的萌發(fā)和生長，愈傷組織勻漿液也可促進菌絲體早期生長。

綜合來看，外生菌根菌在對培養(yǎng)基的要求上差異較大，或者說不同的外生菌根菌可能會有不同的最適于自身的培養(yǎng)基，但目前的研究中一般采用較多的仍是PDA、MMN培養(yǎng)基，然后對它們作一些適當?shù)母倪M。菌根菌較適宜在添加有維生素類物質的天然基質培養(yǎng)基上生長[34]，如添加B族維生素。由于外生菌根菌與宿主植物有著共生關系，這也可考慮在培養(yǎng)基中加入宿主根部提取液，如葉片提取液等。

牛肝菌類真菌的菌絲多從接種塊邊緣長出，棉絮質，菌絲濃密，生長速度緩慢；紅菇科、鵝膏科和口蘑科真菌菌絲短或長絨狀，無或少氣生菌絲，生長速度慢，十分不利于進一步的研究和應用。因此進一步篩選合適的培養(yǎng)基，摸索適宜的分離、培養(yǎng)條件，以提高菌絲的生長速度，對于這些生長緩慢的外生菌根菌的基礎和應用研究將具有十分重要的意義。

2.2 培養(yǎng)條件的篩選

除了找到適宜的培養(yǎng)基以外，選擇合適的培養(yǎng)條件也是菌絲快速、健康生長的關鍵所在。外生菌根菌的生長依賴于環(huán)境中各種生態(tài)因子的協(xié)調，如土壤養(yǎng)分、溫度、pH、濕度及水分等，不同菌種對這些因子的忍受性也影響菌落的生長，其中溫度和pH是最重要的影響因子[35]。

2.2.1 溫度

菌絲在生長過程中對溫度的改變是非常敏感的[36]，溫度是影響外生菌根真菌生長和生理代謝的生態(tài)因子中最重要的因素之一。大部分的外生菌根菌適宜生長溫度約8℃～27℃左右，但不同溫度的生長速率與生長曲線模式可顯示出最佳和不良的菌落生長溫度。畢國昌[37]研究了38種外生菌根菌在不同溫度下的生長狀況，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)菌株自15℃起，菌落生長就迅速加快，到22℃或27℃時，生長速度達到最大。絕大部分菌株的最適生長溫度為25℃，少數(shù)菌種為22℃，還有一些菌株則為27℃。

國立臺灣大學的胡弘道教授[38，39]研究了溫度對塊菌在洋菜培養(yǎng)基上生長的效應，結果顯示不同溫度對臺灣塊菌、印度塊菌、法國黑孢塊菌、意大利白塊菌以及擬外孔塊菌皆呈極顯著差異，且最佳溫度皆為25℃，最差溫度為33℃。國內(nèi)一些研究人員也對各種外生菌根菌適宜生長的溫度進行了初探[40，41]。

2.2.2 pH值

pH值影響到了培養(yǎng)介質中菌根真菌的生長[42]。外生菌根菌比較適宜偏酸性的環(huán)境，一般最適pH值為4～6，大多數(shù)外生菌根菌能忍受的最低pH值為3[43]。盡管有部分菌根真菌其生長最適pH是在堿性條件下，但它們對酸性條件表現(xiàn)出較強的適應能力，這類菌根真菌生長適宜的pH范圍較廣[44]。胡弘道教授[38，39]的實驗結果表明臺灣塊菌與印度塊菌最適pH為6左右，法國黑孢塊菌pH為6，意大利白塊菌pH為5，擬外孔塊菌則不呈現(xiàn)顯著差異。我國的韓桂云等研究表明19種菌根菌有較廣的pH適應范圍[40]。

研究溫度、pH這些生態(tài)因子對外生菌根菌菌絲體的生長發(fā)育的影響，總結溫度、pH的適宜范圍，以便了解不同外生菌根菌的生物學特性及其生理適應能力，進而探討它們生長發(fā)育與生態(tài)分布之間的關系，為今后在林業(yè)生產(chǎn)實踐中因地制宜，廣泛應用菌根技術提供依據(jù)。

3 總結與展望

近幾十年來，國內(nèi)外對外生菌根菌的研究如火如荼地進行著，至今已在很多研究領域取得了突破性的進展，獲得了可喜的成果。在中國，雖然對外生菌根菌的研究起步較晚，但發(fā)展迅速，至今已獲得一些超過世界水平的研究成果，然而外生菌根菌的研究任重道遠，在人工馴化方面遭遇的瓶頸使對其的深入研究勢在必行。從基礎研究著手，不斷成熟，完善實驗技術，希望能從中找到突破口，使外生菌根菌資源得到真正的擴展利用。

在歸納了外生菌根菌的分離與培養(yǎng)后，對此研究提出兩點建議，希望能找到更加合適的菌絲生長模式。一是外生菌根菌分離方法單一，孢子分離法與菌根分離法的技術有待提高與普及；二是發(fā)展液體深層發(fā)酵技術，尋求菌絲快速生長的有效方法。

[1]Harley JL,Smith SE.Mycorrhizal symbiosis[M].London:Academic Press,1983.

[2]Read DJ,Leake JR,Perez－Moreno J.Mycorrhizal fungi as drivers of ecosystem processes in heathland and boreal forest biomes[J].Canadian Journal of Botany,2004(82):1243－1263.

[3]Huang JG,Lapeyrie F.Ability of ectomycorrhizal fungus Laccaria bicolor S238N to increase the growth of Douglas fir seedlings and their phosphorus and potassium uptake[J].Pedosphere,1996,6(3):217－223.

[4]呂小紅.林木外生菌根作用及其機理綜述[J].山西林業(yè)科技，2004(4)：1－3.

[5]卯曉嵐.中國野生食用菌種類及生態(tài)習性[J].真菌學報，1988，7(1)：36－43.

[6]趙經(jīng)周.森林抗癌藥用真菌資源開發(fā)及應用[J].林業(yè)科技通訊，1996(5)：40－41.

[7]Bruns TD,Shefferson RP.Evolutionary studies of ectomycorrhizal fungi:recent advances and future directions[J].Journal Canadien de Botanique,2004,82(8):1122－1132.

[8]Giomaro G,Sisti D,Zambonelli A.Cultivation of edible ectomycorrhizal fungi by in vitro mycorrhizal synthesis[J].Soil Biology,2005,4(4):253-267.

[9]Hall IR,Wang Y,Antonella A.Cultivation of edible ectomycorrhizal mushrooms[J].Trends in Biotechnology,2003,21(10):433-438.

[10]鄭稚鶯，潘學仁，劉振欽，等.食用菌栽培學[M].哈爾濱：哈爾濱出版社，1995.

[11]Danell E,Camacho FJ.Successful cultivation of the golden chanterelle[J].Nature,1997,385(6614):303.

[12]Wang Y,Hall IR,Dixon C,et al.The cultivation of Lactarius deliciosus(saffron milk cap)and Rhizopogon rubescens(shoro)in New Zealand.In edible mycorrhizal mushrooms and their cultivation,proceedings of the second international conference on edible mycorrhizal mushrooms,CD-ROM(Hall,I.R.et al.,eds)[J].New Zealand Institute for Crop&Food Research Limited,2002（7）：66-68.

[13]Poitou N,Mamoun M,Ducamp M,et al.Mycorhization contr?lée et culture expérimentale au champ de Suillus granulatus et Lactarius deliciosus.In proceedings of the twelfth international congress on the science and cultivation of edible fungi(Grabbe,K.and Hilber,O.,eds)[J].Mushroom Science,1989(3):551-563.

[14]Wang Y.Some ectomycorrhizal mushrooms.In edible mycorrhizal mushrooms and their cultivation,proceedings of the second international conference on edible mycorrhizal mushrooms,CD-ROM(Hall IR,et al.,eds)[J].New Zealand Institute for Crop&Food Research Limited,2002(10)：87-89.

[15]Hall IR,Lyon JE,Wang Y,et al.Ectomycorrhizal fungi with edible fruiting bodies.2.Boletus edulis[J].The Society for Economic Botany,1998(52):44-56.

[16]Gregori G.Problems and expectations with the cultivation of Tuber magnatum.In edible mycorrhizal mushrooms and their cultivation,proceedings of the second international conference on edible mycorrhizal mushrooms,CD-ROM (Hall IR,et al.,eds)[J].New Zealand Institute for Crop&Food Research Limited,2002(16)：23-26.

[17]Chevalier G.Synthèse axénique des mycorhizes de Tuber brumale Vitt.à partir de cultures pures du champignon[J].Ann Phytopathol,1973(5):163-182.

[18]顧真榮，紀大干.外生菌根真菌組織分離培養(yǎng)基比較試驗[J].中國食用菌，1987，11(6)：17-19.

[19]Fontana A.Miceli di funghi ipogei in coltura[J].In Atti del Congresso Internazionale sul Tartufo,Spolelo,1968(4):127-133.

[20]Danell E.Cantharellus cibarius:mycorrhiza formation and ecology[J].Acta Univ Ups,Comprehensive Summaries Uppsala Dissertation Faculty of Science and Technology,1994(12):35-75.

[21]Kagan-Zur V.Tuber melanosporum research in Israel.In edible mycorrhizal mushrooms and their cultivation,proceedings of the second international conference on edible mycorrhizal mushrooms,CD-ROM(Hall,I.R.et al.,eds)[J].New Zealand Institute for Crop&Food Research Limited，2002.

[22]Chevalier G,Pollacsek A.Obtention de cultures de mycélium de truffe,à partir du carpophore et des mycorhizes[J].Comptes rendus de l’Académie d’Agriculture de France,1972(12):981-989.

[23]FontanaA,MischiatiP.Invitrocultureof Tubermagnatummyceliumisolatedfrommycorrhizas[J].MycologicalResearch,1993,97(1):40-44.

[24]于富強，紀大干，劉培貴.云南松外生菌根真菌分離培養(yǎng)研究[J].植物研究，2003，23(1)：66-71.

[25]郭學武，姚麗敏，龔建華，等.兩種鵝膏菌純培養(yǎng)菌絲的分離培養(yǎng)和生長形態(tài)[J].中國食用菌，2008，27(3)：27-30.

[26]欒慶書，王淑清，韓瑞興，等.外生菌根菌的采集分離與培養(yǎng)初探[J].遼寧林業(yè)科技，1998(2)：43-45.

[27]林強，陳芳草，林靜，等.塊菌組織分離培養(yǎng)技術研究[J].四川林業(yè)科技，2009，30(6)：55-57.

[28]任桂梅，趙海鷹，鄧振山，等.菌種分離技術及其降低污染率與死亡率實驗教改初探[J].延安大學學報：自然科學版，2007，26(4)：65-67.

[29]欒慶書，李立，李希橋.中國外生菌根研究的20年成就[J].遼寧林業(yè)科技，2000(6)：36-39.

[30]Meyer FH.Physiology of mycorrhiza[J].Annu Rev Plant Physiol,1974(25):567-582.

[31]王曉光，曾憲錄，張秉信.松口蘑菌絲體分離與純培養(yǎng)研究[J].農(nóng)業(yè)與技術，1994(6)：6-9.

[32]Iotti M,Amicucci A,Stocchi V,et al.Morphological and molecular characterization of mycelia of some Tuber species in pure culture[J].New Phytol,2002(155):499-505.

[33]黃光文，張平.共生法培養(yǎng)外生菌根菌菌絲體[J].中國食用菌，2004，24(3)：16-17.

[34]何華，李玉環(huán)，王尚學.云杉、冷杉外生菌根菌培養(yǎng)基篩選試驗[J].食用菌，2010(14)：47-48.

[35]弓明欽，陳應東，仲崇祿，等.菌根研究及應用[M].北京：中國林業(yè)出版社，1997.

[36]Marx DH,Bryan WC,Davey CB.Influence of temperature on aseptic synthesis of ectomycorrhizae by Thelephora terrestris and Pisolithus tinctorius on loblolly pine[J].Forest Science,1970(16):424-431.

[37]畢國昌，郭秀珍，臧穆.在純培養(yǎng)條件下溫度對外生菌根真菌生長的影響[J].林業(yè)科學研究，1989，2(3)：247-252.

[38]胡弘道，王亞男，劉啟福.溫度及pH對臺灣塊菌與印度塊菌菌落在洋菜培養(yǎng)基上生長之效應[J].中華林學季刊，2008，41(1)：43-58.

[39]胡弘道，王亞男，劉啟福.溫度及pH對法國黑孢塊菌、意大利白塊菌與擬外孔塊菌菌落在洋菜培養(yǎng)基上生長之效應[J].中華林學季刊，2008，41(2)：181-198.

[40]韓桂云，齊玉臣，劉忱，等.溫度、pH對菌根真菌生長影響的研究[J].生態(tài)學雜志，1999，12(1)：l5-19.

[41]甘耀坤，陳旭鍵，韋巧春，等.溫度對紅菇菌絲體生長的影響[J].玉林師范學院學報，2007，28(3)：58-64.

[42]Theodorou C,Bowen GD.Mycorrhizal responses of radiate pine in experiments with different fungi[J].Australian Forestry,1970(34):183.

[43]Dennis JJ.Effect of pH and temperature on in vitro growth of ectomycorrhiza fungi[M].Pacific Forestry Centre:Canadian Forest Service Information Report BC-X-273,1985.

[44]Mosse B,Stribley DP,LeTacon F.Advances in microbial ecology,ecology of mycorrhizal and mycorrhizal fungi[J].New York and London:Plenum Press,1981.