膠原酶優(yōu)化消化法對(duì)退變椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞分離培養(yǎng)的作用

馮 旭 ，禹寶慶，劉 莉 ，李承 ，陳安民

（1.上海市浦東醫(yī)院復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院骨科、麻醉科，上海 201399；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院矯形外科，湖北 武漢 430030）

膠原酶優(yōu)化消化法對(duì)退變椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞分離培養(yǎng)的作用

馮 旭1，禹寶慶1，劉 莉1，李承1，陳安民2

（1.上海市浦東醫(yī)院復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院骨科、麻醉科，上海 201399；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院矯形外科，湖北 武漢 430030）

目的 通過觀察不同濃度Ⅰ、Ⅱ型膠原酶對(duì)退變椎間盤纖維環(huán)組織消化效果，探討適合于纖維環(huán)細(xì)胞分離培養(yǎng)的優(yōu)化消化法。方法 收集16例退變椎間盤纖維環(huán)組織，Ⅰ、Ⅱ型膠原酶單獨(dú)消化并在0.1%，0.05%，0.01%濃度下聯(lián)合消化。消化4、8、16、24 h時(shí)倒置顯微鏡下計(jì)算纖維環(huán)細(xì)胞數(shù)，臺(tái)盼藍(lán)染色檢查其活力，并觀察其生長(zhǎng)情況。結(jié)果 Ⅰ、Ⅱ型膠原酶聯(lián)合消化細(xì)胞數(shù)多于單獨(dú)消化細(xì)胞數(shù)。聯(lián)合消化4、8 h時(shí)，細(xì)胞數(shù)隨膠原酶消化濃度增加而增多，16、24 h時(shí)極低濃度組纖維環(huán)細(xì)胞數(shù)逐漸增多，細(xì)胞活力維持在較高水平。結(jié)論 極低濃度Ⅰ、Ⅱ型膠原酶優(yōu)化消化法能節(jié)省酶量，對(duì)細(xì)胞損傷小，更適合纖維環(huán)細(xì)胞分離培養(yǎng)。

膠原酶；優(yōu)化消化法；纖維環(huán)細(xì)胞；分離培養(yǎng)

酶消化法是分離椎間盤纖維環(huán)組織細(xì)胞的常 用方法,有報(bào)道采用鏈酶蛋白酶消化[1]，但成本偏高。實(shí)驗(yàn)中常用胰蛋白酶和膠原酶分離消化椎間盤組織。膠原酶（Collaganase）屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族，在一定的PH及溫度下能溶解椎間盤纖維環(huán)組織。但在何種優(yōu)化條件下充分發(fā)揮膠原酶的活性，對(duì)消化分離的纖維環(huán)細(xì)胞損傷更小，值得進(jìn)一步探討。本文采用I型、Ⅱ型膠原酶單獨(dú)和聯(lián)合消化分離纖維環(huán)細(xì)胞，在消化分離效果好的方式中，探討在不同濃度下對(duì)纖維環(huán)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,觀察其對(duì)纖維環(huán)細(xì)胞數(shù)、活力生長(zhǎng)情況的影響，優(yōu)化選擇最佳濃度的酶消化方法，探討更有利于纖維環(huán)細(xì)胞的培養(yǎng)方法。

1 材料與方法

1.1 一般資料

我院2010-12-2012-12收治的16例腰椎間盤突出癥患者術(shù)中切除的椎間盤纖維環(huán)組織，男9例，女7例；年齡32～52歲，平均36.6歲；其中L4-510例，L5-S16例。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 試劑 采用胰蛋白酶、Ⅰ型和Ⅱ型膠原酶由DMEM/F12培養(yǎng)基配制。

1.2.2 取材 手術(shù)切除腰椎間盤突出癥突出椎間盤髓核組織的同時(shí)，突出部位和毗鄰髓核的部分纖維環(huán)常常被切除。無菌條件下取出纖維環(huán)取出后，立即置入4℃生理鹽水中送實(shí)驗(yàn)室,在無菌操作臺(tái)上用4℃ D-Hanks液沖洗2～3次以清除血液，超凈工作臺(tái)下將髓核與纖維環(huán)、纖維環(huán)交界區(qū)用眼科剪分離，剔除軟骨和肉芽組織，分離出纖維環(huán)組織再放入裝有D-Hanks液的培養(yǎng)皿中，用小剪刀將其剪碎成約1 mm3的組織塊。

1.2.3 細(xì)胞分離 將無菌的纖維環(huán)組織碎塊放入3倍體積的0.25%的胰蛋白酶液中，室溫下消化20 min，胎牛血清中止消化。1000 rpm離心5 min，棄上清液，用DMEM/F12培養(yǎng)基洗滌2次。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)分組情況單獨(dú)或聯(lián)合加用Ⅰ型、Ⅱ型膠原酶進(jìn)行消化，同時(shí)加入10%的胎牛血清。

1.2.4.1 不同類型膠原酶分組 觀察Ⅰ型、Ⅱ型膠原酶對(duì)纖維環(huán)細(xì)胞的分離效果，0.25%胰蛋白酶消化20 min后，分別換成Ⅰ型、Ⅱ型膠原酶單獨(dú)或Ⅰ型+Ⅱ型膠原酶聯(lián)合繼續(xù)消化，分別稱為：Ⅰ組（0.2%Ⅰ型膠原酶）、Ⅱ組（0.2%Ⅱ型膠原酶）和Ⅲ組（0.1%Ⅰ型膠原酶+0.1%Ⅱ型膠原酶），觀察各組消化酶的消化分離效果。

1.2.4.2 不同濃度膠原酶分組 探討纖維環(huán)細(xì)胞分離的最適消化酶濃度，0.25%胰蛋白酶消化20 min后，分別換用濃度為0.1%（Ⅲa組，高濃度組）、0.05%（Ⅲb組，低濃度組）、0.01%（Ⅲc組，極低濃度組）的Ⅰ型+Ⅱ型膠原酶聯(lián)合消化。

1.3 細(xì)胞計(jì)數(shù)與細(xì)胞活力測(cè)定 Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組，Ⅲa，Ⅲb，Ⅲc各組在 37℃消化后 4、8、16、24 h 各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞活力測(cè)定。

1.3.1 細(xì)胞計(jì)數(shù)方法 用平板計(jì)數(shù)器在相差顯微鏡下計(jì)數(shù)，觀察細(xì)胞的分離和生長(zhǎng)情況，計(jì)數(shù)方法參照《體外培養(yǎng)的原理與技術(shù)》[2]。

1.3.2 細(xì)胞活力測(cè)定方法 細(xì)胞分離過程中通過臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算細(xì)胞存活率判斷細(xì)胞活力。步驟如下：將細(xì)胞置于等容積的DMEM／F12培養(yǎng)基和0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液中染色，用平板計(jì)數(shù)器顯微鏡下觀察并記錄細(xì)胞被染色及未被染色的數(shù)量,藍(lán)染細(xì)胞為死亡細(xì)胞,按未被藍(lán)染細(xì)胞所占細(xì)胞總數(shù)的百分比即可初步得到細(xì)胞活力的數(shù)據(jù)。計(jì)算細(xì)胞存活率（染色纖維環(huán)細(xì)胞數(shù)／高倍視野纖維環(huán)細(xì)胞總數(shù)×100%）。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 在纖維環(huán)細(xì)胞消化后4、24 h分別經(jīng)1000 rpm離心5 min，棄去上清液,加入DMEM/F12培養(yǎng)基，經(jīng)孔徑為74 μm的無菌尼龍濾網(wǎng)過濾，計(jì)數(shù)并按1×104 ml密度接種于含10%胎牛血清和DMEM/F12培養(yǎng)基的一次性培養(yǎng)瓶中。各組在膠原酶消化的同時(shí)即加入10%胎牛血清，37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每3 d換液1次。細(xì)胞融合80%時(shí)用胰蛋白酶消化并進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.4.1 體外培養(yǎng)的纖維環(huán)細(xì)胞純化 培養(yǎng)過程中，采用“反復(fù)貼壁法”即將碎塊經(jīng)膠原酶消化后，加入DMEM/F12培養(yǎng)液，分別接種至3個(gè)培養(yǎng)皿中，第1皿接種5 min后，輕輕傾斜吸出培養(yǎng)液，再接種至第2皿中，同法處理，最后接種第3皿。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均以x±s表示，用單因素方差分析進(jìn)行處理。數(shù)據(jù)表中*表示P＜0.05；#P＜0.01。

2 結(jié)果

2.1 纖維環(huán)細(xì)胞計(jì)數(shù) 在37℃消化4、8、16 h、24 h后各組纖維環(huán)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果（見表1）相同膠原酶濃度和相同消化時(shí)間點(diǎn)比較，Ⅲ組細(xì)胞數(shù)多于Ⅰ、Ⅱ組。在Ⅲ組相同消化時(shí)間點(diǎn)比較，消化4、8 h時(shí)，細(xì)胞數(shù)Ⅲa＞Ⅲb＞Ⅲc，16 hⅢc細(xì)胞數(shù)明顯增多，Ⅲa，Ⅲb輕度增多，24 h時(shí)Ⅲa，Ⅲb組纖維環(huán)細(xì)胞減少，Ⅰc組細(xì)胞活力較其他兩組高。

表1 Ⅰ型、Ⅱ型膠原酶單獨(dú)或聯(lián)合消化后不同時(shí)間點(diǎn)纖維環(huán)細(xì)胞數(shù)（×104/ml）

表2 不同濃度Ⅰ+Ⅱ型膠原酶聯(lián)合消化后不同時(shí)間點(diǎn)纖維環(huán)細(xì)胞數(shù)(×104/ml)

2.2 細(xì)胞活力測(cè)定

Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅰ+Ⅱ型膠原酶消化后各時(shí)間點(diǎn)對(duì)纖維環(huán)細(xì)胞存活率的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；Ⅰ+Ⅱ型膠原酶聯(lián)合消化不同濃度組(Ⅲa，Ⅲb，Ⅲc)消化纖維環(huán)細(xì)胞后各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞存活率計(jì)算結(jié)果：不同分離方法的細(xì)胞存活率在接種培養(yǎng)后24 h與接種時(shí)相比，均不同程度降低，其中Ⅲa組細(xì)胞存活率降低幅度最大,表明其毒性較大，在消化24 h后Ⅲc組和Ⅲa組、Ⅲc組和Ⅲb組間均有顯著性差異(P＜0.01)。

表3 Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅰ+Ⅱ型膠原酶消化后不同時(shí)間點(diǎn)纖維環(huán)細(xì)胞存活率(%)

表4 不同濃度Ⅰ+Ⅱ型膠原酶聯(lián)合消化后不同時(shí)間點(diǎn)纖維環(huán)細(xì)胞存活率(%)

2.3 形態(tài)學(xué)觀察 Ⅲa，Ⅲb兩組貼壁速度相對(duì)緩慢，72 h后Ⅲc組細(xì)胞貼壁多于Ⅲa，Ⅲb組。細(xì)胞呈短梭形，輪廓清楚，細(xì)胞核呈圓形（見圖1）。2周后細(xì)胞貼壁數(shù)目明顯增多，但細(xì)胞生長(zhǎng)及分裂增殖慢，大約24 d左右，細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁,即進(jìn)行傳代。傳代后細(xì)胞同樣需要6 d左右貼壁，且生長(zhǎng)較傳代前稍慢，呈現(xiàn)相對(duì)穩(wěn)定的生長(zhǎng)狀態(tài)。

圖1 纖維環(huán)細(xì)胞原代培養(yǎng)3 d貼壁生長(zhǎng)

3 討論

椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞由間充質(zhì)細(xì)胞分化而來，是一種纖維環(huán)軟骨細(xì)胞，常被描述為紡錘形態(tài)的成纖維樣細(xì)胞，其形態(tài)常根據(jù)局部的力學(xué)環(huán)境改變而發(fā)生變化[3，4]。體內(nèi)椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞表達(dá)Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ型膠原和蛋白聚糖亞單位PGS等成分[5]。除了培養(yǎng)基、pH值等影響因素外，其中取材、酶消化法對(duì)纖維環(huán)原代細(xì)胞培養(yǎng)存在重要影響[6]。本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基采用F12/DMEM加10%胎牛血清，每3 d換液一次，以保證細(xì)胞有良好的生長(zhǎng)環(huán)境。貼壁后，細(xì)胞呈梭形，傳代后細(xì)胞有向梭形演變的趨勢(shì)，體現(xiàn)了細(xì)胞有成纖維化的趨勢(shì)。

膠原酶是從溶組織梭狀細(xì)胞芽孢桿菌提取制備的，能特異性水解膠原蛋白的三維螺旋結(jié)構(gòu)，在一定的pH及溫度下能溶解椎間盤纖維環(huán)組織。主要用于消化骨、腎等組織。纖維環(huán)組織的基質(zhì)成分主要是膠原蛋白、蛋白多糖和彈性蛋白等成分。由于粗酶含有各種不同的蛋白酶，也會(huì)消化細(xì)胞表面的蛋白，所以對(duì)細(xì)胞有一定的損傷。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在分離纖維環(huán)細(xì)胞時(shí)，Ⅰ型與Ⅱ型膠原酶聯(lián)合消化比單獨(dú)用Ⅰ型、Ⅱ型膠原酶的酶活性更強(qiáng)。細(xì)胞活力的測(cè)定說明剛分離的細(xì)胞活力較強(qiáng),培養(yǎng)一段時(shí)間后活力最強(qiáng),傳代培養(yǎng)后活力逐漸減弱，符合細(xì)胞的生長(zhǎng)周期。

高濃度消化酶對(duì)細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活性產(chǎn)生一定影響，實(shí)驗(yàn)證實(shí)，極低濃度的Ⅰ、Ⅱ型膠原酶聯(lián)合消化后16 h的纖維環(huán)細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活力更高，而高濃度和中等濃度的膠原酶消化后的細(xì)胞數(shù)開始減少，活力顯著降低，可能是高濃度的消化酶對(duì)細(xì)胞的損傷作用，甚至導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。

人退變椎間盤細(xì)胞的貼壁時(shí)間為5～7 d甚至更長(zhǎng)，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期短，細(xì)胞生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，說明退變的椎間盤細(xì)胞的生長(zhǎng)活力低下。傳代后纖維環(huán)細(xì)胞生長(zhǎng)相對(duì)較快，約24 d可以傳1代，但當(dāng)傳至第2代時(shí)其細(xì)胞內(nèi)空泡增多，分泌顆粒增多，細(xì)胞開始呈現(xiàn)衰老跡象。在Ⅰ型與Ⅱ型膠原酶聯(lián)合消化中，極低濃度（0.01%）更適合于消化纖維環(huán)細(xì)胞。一方面，膠原酶在極低濃度時(shí)消化力較弱，克服了酶活性過強(qiáng)對(duì)纖維環(huán)細(xì)胞活性的影響，對(duì)細(xì)胞的損傷程度相對(duì)較小，這有助于后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)中纖維環(huán)細(xì)胞活力的恢復(fù)和提高；另一方面，極低濃度膠原酶消化法操作簡(jiǎn)單，省略了第一次消化時(shí)除去消化酶時(shí)離心等步驟。由于膠原酶的效價(jià)不象胰蛋白酶那樣受胎牛血清的影響，這就允許在含胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞的同時(shí)，加入膠原酶同步消化纖維環(huán)組織，而極低濃度的膠原酶可在培養(yǎng)的過程中自然消耗掉。

本實(shí)驗(yàn)報(bào)告的極低濃度膠原酶消化法，具有操作方法簡(jiǎn)單、獲得細(xì)胞數(shù)量多且純度高的優(yōu)點(diǎn)。極低濃度消化酶對(duì)纖維環(huán)細(xì)胞造成損傷程度較小，有利于其成活及維持較活躍的功能。

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Effection of optimized digestion of collagenase on the culture of annulus fibrosus cells of degenerated intervetebral disc.

FENG Xu，YU Bao-qing，LIU Li，et al.
（1.Department of Orthopedics、Anesthesia，Pudong Hospital of Shanghai，Shanghai 201399，China；2.Department of Orthopedics Surgery，The Tongji hospital HuaZhong University of Science and Technology TongJi Hospital.）

ObjectiveTo explore the optimized digestive method of collagenase to annulus fibrosus(AF)cells by observing the digestive effects of type I，II collagenase in different concentrations on AF of degenerated intervetebral disc.Methods16 AF samples from human herniated intervertebral disc were collected and digested by type I，II collagenase individually or combined in different concentration.The AF cells were counted with inverted microscope and their activities were checked with trypan blue staining at 4 h、8 h、16 h、24 h after digestion.The growth of AF cells was also observed.ResultsThe amount of AF cells with combined collagenases was more than that seperatedly in the identical concentration.With combined collagenases in 4,8 hours,the higher concentration of collagenases，the more AF cells.The amount of cells in extremely low concentration of collagenases increased at 16 h、24 h，and their activities kept in higher level.ConclusionThe optimized digestion at extremely low concentration of typeⅠand Ⅱcollagenase combination could save enzyme，and is less harmful to AF cells，which is more adapted to separate and culture of AF cells.

collagenase；optimized digestion；annulus fibrosus cell；seperation and culture

Q556.9 文獻(xiàn)辨識(shí)號(hào)：A

1005-7234（2013）05-0361-04

10.3969/j.issn.1005-7234.2013.05.004

2013-07-02；

2013-07-30

馮旭(1971-)，男，湖北籍，副主任醫(yī)師，博士

研究方向：脊柱外科

禹寶慶

電 話：18918790021

電子郵箱：fengalectj@163.com

·臨床論著·