赤雹根總皂苷對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血清OPG/RANKL的影響*

鄒 君，劉永平，顧士棟，閻 昊，佟繼銘

(河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室/承德醫(yī)學院中藥研究所，河北承德 067000)

類風濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種慢性、全身性、自身免疫性綜合征，特征是外周關(guān)節(jié)的非特異性、對稱性炎癥，關(guān)節(jié)滑膜的慢性炎癥、增生，并侵犯關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨、韌帶和肌腱，造成關(guān)節(jié)軟骨、骨和關(guān)節(jié)囊的破壞，最終導致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失。赤雹(Thladiantha DubiaBunge)為葫蘆科多年蔓生草本植物，赤雹根為赤雹的干燥成熟塊根，味苦性寒，主要用于治療各種疼痛等[1-2]。赤雹根總皂苷(total saponins ofThladiantha dubiaroot,TSTDR)為赤雹根主要的有效成分，本課題組的前期研究已證實，TSTDR有很好的抗炎和鎮(zhèn)痛作用，治療RA效果顯著[3-4]。本文旨在探討TSTDR治療RA的作用與調(diào)節(jié)骨保護素(osteoprotegerin,OPG)/核因子-κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-кB ligand,RANKL)系統(tǒng)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 弗氏完全佐劑，美國Sigma公司，批號:100M8725;雷公藤多苷片，安徽新隴海藥業(yè)有限公司，批號:110301;大鼠OPG ELISA試劑盒，上海索寶生物科技有限公司，批號:DRE20631;大鼠RANKL ELISA試劑盒，上海索寶生物科技有限公司，批號:DRE20520;TSTDR，承德醫(yī)學院中藥研究所藥理毒理研究室制備。

1.2 實驗動物分組及處理 6周齡SD大鼠(雄性)，體重180-220g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號:SCXK京2009-0007。36只SD大鼠，隨機取6只作為空白對照組，其余大鼠均于右后足跖部皮下注射0.1ml弗氏完全佐劑(12mg/L)制備佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis，AA)大鼠模型，以在注射點周圍出現(xiàn)明顯的突起白泡為佳。致炎后第18d，采用關(guān)節(jié)炎分數(shù)評分法計算關(guān)節(jié)炎指數(shù)AI值(按照1.3的方法)，以AI值≥6作為模型成功的標準。成模大鼠隨機分為模型組，TSTDR 160、80、40mg/kg/d組(高、中、低劑量組)和雷公藤多苷12 mg/kg/d組，每組6只。各用藥組大鼠分別灌胃給予相應的藥物，正常對照組、模型組大鼠灌胃給予等容積蒸餾水，各組大鼠均連續(xù)給藥21天。

1.3 計算AI值 0級:無紅腫，0分;1級:足小趾關(guān)節(jié)紅腫，1分;2級:趾關(guān)節(jié)、足跖部均紅腫，2分;3級:踝關(guān)節(jié)以下均紅腫，3分;4級:包括踝關(guān)節(jié)全部紅腫，4分。AI值=非致炎3只肢體關(guān)節(jié)腫脹級別之和(最高分為12 分)。

1.4 指標檢測 給藥結(jié)束后第2d，大鼠麻醉后腹主動脈采血，離心(3500r/min，10min)取血清，-80℃冰箱保存。采用ELISA法檢測大鼠血清RANKL和OPG的水平，并計算二者的比值。

1.5 統(tǒng)計分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，結(jié)果以(±s)表示，各組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

模型組大鼠的OPG/RANKL比值明顯低于正常對照組(P＜0.01)，TSTDR各劑量組、雷公藤多苷組大鼠的OPG/RANKL比值明顯高于模型組(P＜0.01)。見附表。

附表 大鼠血清OPG和RANKL水平檢測結(jié)果(n=6±s)

附表 大鼠血清OPG和RANKL水平檢測結(jié)果(n=6±s)

與模型組比較:△P＜0.01

組別 劑量(mg/kg/d)OPG(pmol/L)RANKL(pmol/L)OPG/RANKL正常對照組 -- 98.335±3.801 47.262±4.868 2.040±0.309△模型組 -- 53.637±3.463 120.799±12.141 0.433±0.063 TSTDR低劑量組 40 71.668±2.618 98.738±10.171 0.710±0.081△TSTDR中劑量組 80 77.501±0.9291 87.810±17.778 0.888±0.169△TSTDR高劑量組 160 91.037±7.264 77.751±14.612 1.128±0.236△雷公藤多苷組 12 83.334±3.966 88.601±9.022 0.925±0.125△

3 討論

RA顯著的病理特征是持久關(guān)節(jié)滑膜炎癥引起的關(guān)節(jié)骨質(zhì)破壞。大量研究證實，破骨細胞(Osteoclast，OC)的增殖和活化在軟骨和骨的破壞過程中起著核心作用[5]。一般認為，OC的增殖和活化有兩個信號傳導途徑:RANKL/RANK/NF-κB通路和炎癥因子介導的非RANKL/RANK/NF-κB 依賴通路[6-7]。Gravallese 等[8]利用RANKL基因敲除小鼠模型誘發(fā)關(guān)節(jié)炎，發(fā)現(xiàn)雖然炎癥仍然繼續(xù)發(fā)展，但基因敲除小鼠骨質(zhì)損傷比對照組顯著減輕，說明在這兩條通路中RANKL介導的通路在RA骨破壞中起主要作用。RANKL與RANK結(jié)合促進OC及其前體細胞分化、成熟和活化，并阻止OC凋亡。OPG是RANKL的天然阻滯受體，可阻斷RANKL與RANK的結(jié)合，減輕關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨的破壞[9]。根據(jù)文獻，RA模型RANKL水平均降低，但RA時OPG水平的變化文獻報道不一，但OPG/RANKL比值均降低[10-11]。因此認為，OPG/RANKL比值的改變與RA骨破壞密切相關(guān)。

中藥治療RA療效好、副作用小、遠期療效可靠。本課題組的前期已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，赤雹根能明顯減輕AA模型大鼠的疼痛反應和炎癥反應，還能影響多種炎癥因子在血清和組織中的表達[3-4,12]。本研究結(jié)果顯示，AA模型組大鼠OPG/RANKL比值較正常對照組顯著降低，高、中、低劑量TSTDR均能明顯提高模型大鼠的OPG/RANKL比值，表明TSTDR能抑制RA時關(guān)節(jié)骨的破壞，從而有助于控制RA的進一步發(fā)生發(fā)展。

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