味覺(jué)厭惡學(xué)習(xí)對(duì)大鼠舌乳頭上皮leptin表達(dá)的影響

李海艷，程振宇

(承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000)

動(dòng)物攝取某種新異的味覺(jué)刺激后，若出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹瀉等內(nèi)臟不適，動(dòng)物便可“記住”這種食物的味覺(jué)特征，減少或拒絕攝取具有相同味覺(jué)特征的食物，這種行為的變化過(guò)程稱(chēng)為條件性味覺(jué)厭惡學(xué)習(xí)(CTA)，是動(dòng)物避免重復(fù)攝取有毒物質(zhì)的一種重要學(xué)習(xí)機(jī)制。味覺(jué)對(duì)于調(diào)節(jié)攝食，控制體重起著重要作用。脂肪細(xì)胞產(chǎn)生的瘦素(leptin)能夠調(diào)整食物的吸收、能量的消耗和體重。目前認(rèn)為，味覺(jué)器官是leptin作用于外周的靶器官之一，leptin通過(guò)與味覺(jué)細(xì)胞的ob-Rb受體結(jié)合抑制機(jī)體對(duì)甜味物質(zhì)的反應(yīng)，降低味覺(jué)感受器的敏感性。因此，由leptin引起的味覺(jué)改變可能參與了對(duì)食物吸收的調(diào)整[1]。本研究通過(guò)建立大鼠CTA模型，采用免疫組化染色法觀察了CTA模型大鼠舌乳頭上皮leptin表達(dá)的變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 清潔級(jí)成年雄性SD大鼠20只，體重250-300g，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號(hào):SCXK(冀)2008-1-003)。大鼠隨機(jī)分為CTA組和對(duì)照組，每組10只大鼠，兩組均進(jìn)行口腔插管手術(shù)，建立模型時(shí)CTA組腹腔注射LiCl(20ml/kg)、對(duì)照組腹腔注射生理鹽水(20ml/kg)。

1.2 CTA模型的建立

1.2.1 口腔插管手術(shù):大鼠腹腔注射0.5%戊巴比妥鈉(45mg/kg)麻醉，固定于腦立體定位儀上，暴露頂骨。將醫(yī)用單孔聚乙烯管的一端，由皮膚切口處經(jīng)耳眼間皮下組織導(dǎo)入大鼠頰部并穿入口腔，在口腔內(nèi)加一墊圈固定;在頂骨表面固定兩個(gè)螺絲釘，將導(dǎo)管上端用牙托粉固定于螺絲釘上，傷口處灑上滅菌結(jié)晶磺胺消炎。

1.2.2 建立模型:口腔插管手術(shù)后3-5d，經(jīng)口腔插管向口腔內(nèi)注入0.2mol/L蔗糖溶液5ml，5min內(nèi)注完;20min后，腹腔注射0.15mol/L的LiCl(20ml/kg)。禁食禁水12h后，用兩瓶法測(cè)定水和蔗糖的攝取量。如果對(duì)蔗糖的攝取量小于0.5ml，說(shuō)明建立了一次CTA，重復(fù)建立3次予以鞏固。

1.3 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)leptin的表達(dá) 造模成功后，大鼠腹腔注射25%氨基甲酸乙酯(2g/kg)麻醉，打開(kāi)胸腔暴露心臟，經(jīng)升主動(dòng)脈插管，150ml生理鹽水快速灌流沖洗，然后用4%多聚甲醛灌流固定1.5h，取舌，入4%多聚甲醛后固定4-6h，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚5μm。采用SP免疫組織化學(xué)染色法觀察大鼠舌l(xiāng)eptin的表達(dá)，兔抗leptin多克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)1:300稀釋?zhuān)珼AB(美國(guó)Sigma公司)顯色，蘇木素復(fù)染。陰性對(duì)照以PBS代替一抗。

1.4 切片觀察和細(xì)胞計(jì)數(shù) 每只大鼠觀察5張切片，每張切片在200倍顯微鏡下取6個(gè)視野，Image-Pro Plus(IPP)分析軟件系統(tǒng)自動(dòng)計(jì)數(shù)兩種舌乳頭上皮限定面積(絲狀乳頭和菌狀乳頭，270μm×250μm)內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目，換算為單位面積內(nèi)leptin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(/mm2)，取平均值作為該舌乳頭上皮leptin蛋白表達(dá)的相對(duì)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，兩樣本均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

絲狀乳頭、菌狀乳頭和輪廓乳頭上皮均可見(jiàn)leptin免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞，leptin陽(yáng)性產(chǎn)物位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色。與對(duì)照組比較，CTA組大鼠舌乳頭上皮的染色明顯加深，且CTA組大鼠舌絲狀乳頭、菌狀乳頭上皮leptin的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見(jiàn)附表。

附表 各組大鼠舌乳頭上皮leptin的表達(dá)(±s，單位:細(xì)胞數(shù)/mm2)

附表 各組大鼠舌乳頭上皮leptin的表達(dá)(±s，單位:細(xì)胞數(shù)/mm2)

組別 n 絲狀乳頭 菌狀乳頭對(duì)照組 10 84.66±6.23 60.91±17.25 CTA組 10 173.55±15.07 179.42±26.13 P ＜0.01 ＜0.01

3 討論

leptin是肥胖基因(ob基因)的蛋白產(chǎn)物，主要在脂肪組織中表達(dá)，被認(rèn)為是一種飽食信號(hào)，主要調(diào)節(jié)能量平衡和控制體重。向遺傳性肥胖小鼠(ob小鼠)的腦脊液注入leptin后，小鼠的進(jìn)食量明顯減少，體質(zhì)量也逐漸下降[2]。Monteleone等[3]和Waelput等[4]發(fā)現(xiàn)，leptin具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng):一是通過(guò)作用于下丘腦的攝食中樞產(chǎn)生飽脹感，從而抑制攝食行為;二是作用于其它組織的leptin受體，包括肝、脾、肺、腎、心、胰腺等，直接或間接發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[5]。目前，有研究認(rèn)為leptin也可作用于味覺(jué)器官。

動(dòng)物建立味覺(jué)厭惡學(xué)習(xí)后，有惡心、嘔吐、腹瀉等內(nèi)臟不適的表現(xiàn)，對(duì)攝食的適應(yīng)性調(diào)節(jié)能力降低，進(jìn)而導(dǎo)致胃排空的延遲。leptin水平及其受體表達(dá)的多少和性狀的改變，可以改變胃的順應(yīng)性，抑制攝食，延遲胃排空。原因是leptin可直接激活迷走神經(jīng)傳入神經(jīng)元，刺激信號(hào)通過(guò)迷走神經(jīng)到達(dá)孤束核(NTS)刺激leptin敏感神經(jīng)元，再作用于下丘腦外側(cè)區(qū)(LH)、下丘腦腹內(nèi)側(cè)區(qū)(VMH)及弓狀核(ARC)，抑制胃的運(yùn)動(dòng)和攝食，因此提示leptin能夠調(diào)節(jié)攝食、調(diào)節(jié)胃排空[6]。近年有研究報(bào)道，leptin還能影響小鼠的記憶和學(xué)習(xí)活動(dòng)。敲除leptin受體基因的db/db小鼠，依然能建立條件性味覺(jué)厭惡學(xué)習(xí)，但卻加快了CTA的消退過(guò)程，原因可能是leptin受體差異性地分布于CTA相關(guān)腦區(qū)[7]。另外，leptin可能通過(guò)杏仁核、海馬、皮質(zhì)、臂旁核的leptin受體發(fā)揮作用，而且leptin受體在CTA大鼠腦內(nèi)神經(jīng)元中表現(xiàn)出內(nèi)移現(xiàn)象，表明在CTA的形成和維持中，leptin受體的活性或功能發(fā)生了變化，提示leptin在味覺(jué)和內(nèi)臟信息的相互作用中具有重要作用[8]。而CTA也是味覺(jué)信息和內(nèi)臟信息發(fā)生整合作用的結(jié)果，動(dòng)物建立CTA后是否會(huì)影響外周器官—舌l(xiāng)eptin的表達(dá)，目前尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠絲狀乳頭、菌狀乳頭及輪廓乳頭上皮均可見(jiàn)leptin表達(dá)，并且CTA大鼠舌絲狀乳頭、菌狀乳頭上皮leptin的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組大鼠;因此提示CTA影響了leptin蛋白在舌乳頭上皮的表達(dá)，進(jìn)一步闡明了CTA和leptin蛋白的關(guān)系，充實(shí)了CTA理論，但相關(guān)機(jī)制有待于深入研究。

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