VPA聯(lián)合As2O3對(duì)NB4細(xì)胞VEGF及Survivin表達(dá)的影響*

王陶然，張志華，王麗紅，趙 蕾，郝長(zhǎng)來

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血液病科，河北承德 067000)

急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)是FAB分型中的M3型急性白血病，骨髓中以顆粒增多的早幼粒細(xì)胞為主，以往APL的治療效果很差，預(yù)后兇險(xiǎn)，多因并發(fā)彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)或原發(fā)性纖維蛋白溶解導(dǎo)致嚴(yán)重出血，造成早期死亡[1]。三氧化二砷(arsenic trioxide，As2O3)可通過誘導(dǎo)分化和促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡達(dá)到治療目的，是治療APL有效、安全的藥物，具有骨髓抑制輕等優(yōu)點(diǎn)，尤其適用于對(duì)維甲酸耐藥的難治病例。但在臨床治療過程中發(fā)現(xiàn)，As2O3治療早期可以誘導(dǎo)分化階段的白細(xì)胞急劇增長(zhǎng)，白血病細(xì)胞的浸潤(rùn)增加了病人治療的危險(xiǎn)性。有學(xué)者認(rèn)為，白血病細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象與小劑量的As2O3能使APL細(xì)胞株(NB4)細(xì)胞分泌更多的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)有關(guān)。Survivin基因是近年發(fā)現(xiàn)的一種抑制凋亡的新基因，屬于凋亡蛋白抑制家族(IAP)成員。研究發(fā)現(xiàn)，Survivin與血管生成密切相關(guān)[2]。丙戊酸鈉(valproic acid，VPA)是臨床上廣泛應(yīng)用的廣譜抗癲癇藥，近年的研究發(fā)現(xiàn)，VPA屬于組蛋白去乙?；敢种苿?，具有抑制組蛋白去乙?；富钚缘淖饔茫勺璧K血管生成、抑制轉(zhuǎn)移，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。本研究以NB4細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察VPA聯(lián)合As2O3對(duì)NB4細(xì)胞VEGF及Survivin表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 NB4細(xì)胞株，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所王建祥教授惠贈(zèng)。VPA，美國(guó)Sigma公司，用滅菌注射用水稀釋，-20℃冰箱密閉避光保存，臨用前用不含血清和抗生素的RPMI 1640液稀釋至所需濃度。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) NB4細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，同時(shí)加入青霉素(100U/mL)和鏈霉素(100U/mL)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 將NB4細(xì)胞懸液調(diào)整為1×105/ml，接種于培養(yǎng)瓶，每瓶10ml。實(shí)驗(yàn)組分別加入As2O30.1μmol/L、As2O30.1μmol/L+VPA 1.0mmol/L，對(duì)照組不加藥。

1.4 NB4細(xì)胞VEGF和Survivin mRNA表達(dá)的檢測(cè) 采用RTPCR法檢測(cè)VEGF和Survivin mRNA的表達(dá)。收集不同藥物處理48h的NB4細(xì)胞，按Trizol試劑盒說明書操作提取總RNA，取適量DEPC水溶解沉淀，用紫外分光光度計(jì)在260nm和280nm處測(cè)A值，OD260/OD280為1.8-2.0，根據(jù)A260值計(jì)算RNA濃度。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，分別用VEGF、Survivin和β-actin引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。VEGF上游引物:5’-GAAGTGGTGAAGTTCATGGATGTC-3’， 下游引物:5’-CGATCGTTCTGTATCAGTCTTTCC-3’，產(chǎn)物大小409bp;Survivin上游引物:5’-CTTTCTCAA GGACCACCGCATC-3’，下游引物: 5’CAATCCATG GCAGCCAGCTGC-3’，產(chǎn)物大小393bp;β-actin上游引物:5’-ACACTGTGCCCATCTACGAGG -3’，下 游引物:5’- AGGGGCCGGACTCGTCATACT -3’，產(chǎn)物大小621bp。PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃ 5min、變性95℃45s、退火58℃ 1min、延伸72℃ 1min，38 個(gè)循環(huán)，終延伸72℃ 8min。取PCR產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠(含0.5mg/L溴化乙錠)電泳，80V、電泳30-50min，凝膠成像系統(tǒng)照相，圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)吸光度(A)值，與β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物的A值進(jìn)行比較，計(jì)算目的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，多組間采用方差分析及LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

半定量RT-PCR分析顯示，As2O30.1μmol/L組NB4細(xì)胞VEGF mRNA的表達(dá)明顯高于對(duì)照組、Survivin mRNA的表達(dá)明顯低于對(duì)照組(P＜0.05);與As2O30.1μmol/L組比較，As2O30.1μmol/L+VPA 1.0mmol/L 組NB4細(xì)胞VEGF mRNA、Survivin mRNA的表達(dá)均明顯降低(P＜0.05)。見附表。

附表 NB4細(xì)胞VEGF和Survivin mRNA的表達(dá)(±s)

附表 NB4細(xì)胞VEGF和Survivin mRNA的表達(dá)(±s)

與對(duì)照組比較:*P＜0.05，與As2O3組比較:#P＜0.05

組別 VEGF mRNA Survivin mRNA對(duì)照組 0.268±0.010 0.927±0.010 As2O3 0.1μmol/L組 0.456±0.026* 0.832±0.049*As2O3 0.1μmol/L+VPA 1.0mmol/L組 0.254±0.009# 0.337±0.054#

3 討論

APL是一種特殊的髓細(xì)胞性白血病，具有獨(dú)特的細(xì)胞形態(tài)學(xué)和生物學(xué)特征，因早期出血傾向嚴(yán)重，易并發(fā)DIC及原發(fā)性纖溶亢進(jìn)導(dǎo)致病死率較高。As2O3是治療APL安全、有效的藥物，在臨床上取得了良好的治療效果[3]。但As2O3具有早期誘導(dǎo)分化階段白細(xì)胞急劇增長(zhǎng)的作用，白血病細(xì)胞的浸潤(rùn)增加了病人治療的危險(xiǎn)性。如何減輕As2O3的毒副作用而不影響其療效，是臨床工作者和科研人員面臨的一個(gè)重要課題。聯(lián)合用藥、多靶點(diǎn)治療是腫瘤防治的一個(gè)新策略，有效的聯(lián)合用藥不但可增強(qiáng)對(duì)腫瘤的療效，而且能通過減少單個(gè)藥物的劑量降低藥物的副作用。

有研究表明，白血病細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象與VEGF有關(guān)，小劑量As2O3在誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡的同時(shí)還能使其分泌更多的VEGF[4]。本研究亦證實(shí)了這一點(diǎn)，0.1μmol/L的As2O3作用于NB4細(xì)胞48h后，與對(duì)照組相比，VEGF mRNA的表達(dá)明顯升高、Survivin mRNA的表達(dá)明顯降低。VEGF表達(dá)增加不僅促進(jìn)白血病細(xì)胞自身的增殖，還可刺激血管內(nèi)皮生長(zhǎng)、促進(jìn)血管生成，為腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)提供有利條件和骨髓微環(huán)境[5]。因此推測(cè)，小劑量As2O3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的同時(shí)還伴有一定程度的誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和浸潤(rùn)的作用。Survivin基因是目前已知作用最強(qiáng)的抑制蛋白，具有抗凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖、血管生成等功能，被認(rèn)為是抗腫瘤藥物的新靶點(diǎn)[6]。Survivin是一個(gè)在血管形成過程中表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)基因，不僅可以抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，而且可抑制腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，VEGF在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，不僅直接促進(jìn)血管的形成，還可誘導(dǎo)Survivin表達(dá)，產(chǎn)生抗凋亡作用，導(dǎo)致血管過度增生。二者共同作用，促進(jìn)血管形成，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7]。

VPA是一種廣泛應(yīng)用于臨床的古老的抗癲癇藥物，近年的研究發(fā)現(xiàn)，VPA具有組蛋白去乙?；敢种苿?HDACi)的作用。VPA作用于腫瘤細(xì)胞時(shí)，可阻滯腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞自我吞噬。此外，VPA還能夠抑制腫瘤血管生成，使腫瘤細(xì)胞因缺血、缺氧而死亡，從而延緩腫瘤生長(zhǎng)和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[8]。本研究結(jié)果顯示，VPA聯(lián)合小劑量As2O3可以降低單獨(dú)應(yīng)用As2O3導(dǎo)致的NB4細(xì)胞VEGF表達(dá)的升高、并進(jìn)一步降低Survivin的表達(dá)，表明As2O3聯(lián)合VPA具有降低As2O3不良反應(yīng)，加強(qiáng)As2O3促凋亡和抗血管新生的作用。本研究對(duì)臨床提高應(yīng)用As2O3治療APL患者的療效，探討聯(lián)合治療具有重要意義。

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