大腸癌原代細胞培養(yǎng)方法的探索

袁航，屠世良

（浙江省人民醫(yī)院 肛腸外科，浙江 杭州 310014）

由體內(nèi)直接取出組織或細胞進行培養(yǎng)叫原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)細胞離體時間短，性狀與體內(nèi)相似，適用于腫瘤發(fā)生機制、抗腫瘤藥物檢測、癌分子生物學(xué)等研究。較之目前國內(nèi)大腸癌細胞研究多采用細胞株的方式，原代培養(yǎng)更符合體內(nèi)生理狀態(tài)，其實驗數(shù)據(jù)更具有說服力。但原代培養(yǎng)因成功率低，時間、試劑、人力成本高等原因，未能被廣泛應(yīng)用。本研究通過綜合國內(nèi)外大腸癌細胞原代培養(yǎng)方法的報道，對各種培養(yǎng)方法加以改進利用，尋求更優(yōu)化更高效的原代培養(yǎng)方法，以期為大腸癌基礎(chǔ)研究做準備工作。

1 材料和方法

1.1 實驗標本 標本來自手術(shù)切除的未經(jīng)放射治療和抗腫瘤化學(xué)藥物治療的新鮮無菌人大腸癌組織。大腸癌診斷以腫瘤組織的病理學(xué)檢查為依據(jù)。取材按腫瘤大體類型、腫瘤分化程度、取材位置分類。

按腫瘤大體類型：①腫塊增生型：主要向腸腔內(nèi)生長，呈球狀或半球狀；②潰瘍浸潤型：中央部壞死，形成大潰瘍，邊緣外翻呈蝶形，或癌組織沿腸壁浸潤生長，有明顯纖維組織反應(yīng)。

按腫瘤分化程度：癌細胞排列呈腺管狀或腺泡狀，按Broder法分為高分化（I級）、中分化（II級）、低分化（III級）和未分化（IV級）癌。取材時按照I～II級、III～IV級進行分類。

按取材位置：①腫瘤中央；②腫瘤周邊。按以上分類標準配對，即有8個取材方案。

1.2 試劑及儀器 RPMI 1640培養(yǎng)液（含100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素、10μg/mL胰島素、生長激素100μg/L）、DMEM細胞培養(yǎng)基、Hanks洗液（含1000 U/mL青霉素、1000 U/mL鏈霉素、3μg/mL兩性霉素）、胎牛血清、眼科剪、眼科鑷、細胞計數(shù)板、自制鼠尾膠原鋪制的培養(yǎng)瓶、CO2培養(yǎng)箱、倒置相差顯微鏡（Olympus）、超凈工作臺。

1.3 實驗方法

1.3.1 不同取材標本對原代培養(yǎng)的影響：對培養(yǎng)條件采用正交設(shè)計進行研究[1]。如表1所示，按之前8個取材方案在2個不同標本中重復(fù)實驗1次，進入表格內(nèi)按不同方案培養(yǎng)，即組織塊培養(yǎng)法+RPMI 1640培養(yǎng)基，組織塊培養(yǎng)法+DMEM培養(yǎng)基，膠原酶消化法+RPMI 1640培養(yǎng)基，膠原酶消化法+DMEM培養(yǎng)基。注意取材部位非常重要，體積較大的腫瘤組織中有退變或壞死區(qū)，取材時盡量避開，要挑選活力較好的部位。予培養(yǎng)3、7 d觀察培養(yǎng)基中細胞分布情況，以組織塊周圍細胞生長來判斷原代細胞生長情況。

表1 采取正交設(shè)計的實驗方案

1.3.2 不同培養(yǎng)方法對原代培養(yǎng)的影響：對手術(shù)切取的組織分別用組織塊培養(yǎng)法和膠原酶消化法進行原代培養(yǎng)。①組織塊培養(yǎng)法：將手術(shù)切除的腫瘤組織放入轉(zhuǎn)移用RPMI 1640培養(yǎng)基（添加10倍常規(guī)抗生素的用量）中，盡快轉(zhuǎn)移到實驗室進行操作。在超凈工作臺上將癌組織取出，置于無菌平皿中，用無菌眼科剪、眼科鑷去除壞死組織、脂肪組織和血凝塊，選擇肉眼觀察瘤組織表面無潰爛的組織，將其置于15 mL離心管中，Hanks洗液沖洗去除紅細胞及表面污物。使用無菌眼科剪鑷將組織塊剪成1 mm3小塊，置于無菌塑料離心管中，用Hanks洗液重懸，吸棄上清，重復(fù)用RPMI 1640培養(yǎng)液重懸，清洗離心分離，吸棄上清，用滴管將小組織塊均勻地排布在培養(yǎng)瓶底部，先將培養(yǎng)瓶底朝上放置，培養(yǎng)一段時間后將培養(yǎng)瓶正放，繼續(xù)培養(yǎng)，以組織塊周圍有細胞生長為培養(yǎng)成功的標準。②膠原酶消化

法：將組織碎塊移入15 mL玻璃離心管中，加入5～10 mL IV型膠原酶消化液，放入37 ℃水浴中，不斷振蕩，連續(xù)觀察1 h，直至組織碎塊彌散開為止，收集細胞懸液，將細胞懸液通過200目無菌的不銹鋼篩網(wǎng)，移除大的細胞團塊，已過篩網(wǎng)的液體轉(zhuǎn)移入25 cm2預(yù)先鋪好鼠尾膠原的培養(yǎng)瓶中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3 不同培養(yǎng)基對原代培養(yǎng)的影響：重復(fù)1.3.2步驟，不同的是將用RPMI 1640培養(yǎng)基（包括轉(zhuǎn)移用RPMI 1640）處改用DMEM培養(yǎng)基（添加相同濃度胰島素、生長激素），培養(yǎng)瓶瓶底均用鼠尾膠原包被。

1.3.4 不同純化方法對原代培養(yǎng)的影響：對之前培養(yǎng)無污染且細胞絕對數(shù)量相對較多的標本進行純化。成纖維細胞的混合生長是影響腫瘤細胞生長的主要原因，因此需要去除成纖維細胞。①胰酶消化法：此法利用細胞對胰酶消化敏感性的差異，達到細胞純化的目的。國外許多學(xué)者的經(jīng)驗表明，當腫瘤組織塊貼壁后，其癌細胞成片生長，形成集落，常常抑制了雜細胞的生長[2-3]，但也存在少量的雜細胞。因此，我們暫不對貼壁的細胞進行純化，當細胞培養(yǎng)至15～20 d后組織塊（包括無活性的腫瘤細胞、破碎細胞和成纖維細胞等）自動脫落，棄去漂浮的組織塊后對貼壁的細胞進行純化。取出培養(yǎng)瓶，棄掉培養(yǎng)基，加入5 mL PBS沖洗后，吸除PBS。加1.5 mL 0.25%的胰酶，前后旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶4～5次，使胰蛋白酶包被所有瓶內(nèi)細胞，放入37 ℃細胞培養(yǎng)箱中2 min。取出培養(yǎng)瓶在倒置顯微鏡下觀察，可見部分細胞首先變圓、脫落被消化下來，這時停止消化。這些首先被消化下來的細胞為成纖維細胞，吸除成纖維細胞及消化液。加入5 mL培養(yǎng)液，用吸管吹打細胞，收集細胞懸液。離心后棄上清。加入PBS洗滌細胞沉淀，再離心棄上清，再加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。②機械刮除法：用不銹鋼絲末端插橡膠刮頭或裹少許脫脂棉制成，高壓滅菌后備用。用不脫色筆在培養(yǎng)瓶皿的背面圈下生長腫瘤細胞的部位；棄掉培養(yǎng)液，把無菌膠刮伸入瓶皿中，肉眼或顯微鏡下，刮除無標記空間；再用Hanks液沖洗1～2次，洗除被刮掉的細胞；繼續(xù)培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)成纖維細胞殘留，重復(fù)刮除至完全除掉為止。③反復(fù)貼壁法：根據(jù)腫瘤細胞比成纖維細胞貼壁速度慢的特點，并結(jié)合使用不加血清的營養(yǎng)液，把含有兩類細胞的細胞懸液反復(fù)貼壁，使兩類細胞分離，操作方法與傳代相同，具體如下：待細胞生長達一定數(shù)量后，倒出舊培養(yǎng)液，用胰酶消化后，Hanks液沖洗2次，加入不含血清的培養(yǎng)液，吹打制成細胞懸液；取三個培養(yǎng)瓶編號為A、B、C；首先把懸液接種入A瓶中，置溫箱中靜止培養(yǎng)5～20 min后，輕輕傾斜培養(yǎng)瓶，讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養(yǎng)液，接種入B瓶后，向A瓶中補充少許完全培養(yǎng)液置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)；培養(yǎng)B瓶中培養(yǎng)細胞5～20 min后，按處理A瓶的方法，把培養(yǎng)液注入C瓶中，再向B瓶中補加完全培養(yǎng)基。三個培養(yǎng)瓶內(nèi)均含有培養(yǎng)液，在溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。如操作成功，次日觀察可見A瓶主要為成纖維細胞，B瓶兩類細胞相雜，C瓶主要為癌細胞。必要時可反復(fù)處理多次，直至癌細胞純化為止。

1.3.5 細胞成活率的檢查：將培養(yǎng)不同時間的細胞于倒置顯微鏡下進行形態(tài)學(xué)觀察，注意細胞的生長情況。必要時行細胞活力測定（采用臺盼藍染色法），確定群體細胞中存活的細胞數(shù)。

1.3.6 培養(yǎng)細胞的鑒定：取已處理的細胞爬片，蒸餾水沖洗，PBS浸泡，H2O2去離子水孵育，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性；滴加適當比例稀釋的一抗，4 ℃過夜；PBS沖洗。采用免疫細胞化學(xué)法標記癌胚抗原（carcino-embryonic antigen，CEA）、上皮細胞角質(zhì)蛋白20（homo sapiens keration 20，CK 20）、外周血上皮膜抗原（epithelial membrane antigen，EMA）。

2 結(jié)果

2.1 不同取材標本對原代培養(yǎng)的影響 所有取材、轉(zhuǎn)移、組織塊處理、換液等操作均由同一位具有豐富細胞培養(yǎng)經(jīng)驗的實驗員操作。

2.1.1 腫瘤大體類型：腫塊增生型、潰瘍浸潤型各32例。結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫塊增生型腫瘤組織厚實，取材范圍大，難度相對較小，污染率低。潰瘍浸潤型腫塊易污染。腫塊增生型前3 d內(nèi)8例未污染，但7 d后2例換細胞液時發(fā)生污染，4例發(fā)現(xiàn)雜細胞優(yōu)勢生長，腫瘤細胞數(shù)量極少，2例培養(yǎng)出腫瘤細胞并順利傳代。潰瘍浸潤型培養(yǎng)大部分污染，3例起初（7 d內(nèi)）未污染但14 d后換液傳代時污染2例，1例發(fā)現(xiàn)雜菌優(yōu)勢生長。

2.1.2 腫瘤分化程度：I～II級和III～IV級各32例，各有5例和6例未污染。低分化級別短期生長可表現(xiàn)出明顯活力，細胞數(shù)稍多于中分化，但從長期生長結(jié)果來看未發(fā)現(xiàn)細胞數(shù)可明顯增多。2例培養(yǎng)出腫瘤細胞并順利傳代，1例分化為II級，1例分化為III級。

2.1.3 取材位置：腫瘤中央取材和腫瘤周邊取材各32例。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腫瘤中央取材腫瘤細胞容易取得壞死物而培養(yǎng)失敗，但如取得腫塊深部組織則細胞活力好，2例培養(yǎng)出滿意細胞均為腫塊增生型中央深部取材獲得。

2.2 不同培養(yǎng)方法對原代培養(yǎng)的影響 組織塊培養(yǎng)法進行腫瘤細胞培養(yǎng)，細胞一般2～3 d后從組織塊周圍爬出，見圖1。倒置顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察，組織塊邊緣可見有細胞游出，繼續(xù)培養(yǎng)待組織塊脫落純化后，可見腫瘤細胞生長，細胞呈不規(guī)則形、多角形。2例培養(yǎng)成功的細胞均采用組織塊培養(yǎng)法。膠原酶消化法培養(yǎng)的細胞，僅有少量細胞貼壁，繼續(xù)培養(yǎng)一段時間，細胞數(shù)目不理想。

圖1 組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)20 d可見腫瘤細胞游出

2.3 不同培養(yǎng)基對原代培養(yǎng)的影響 我們對培養(yǎng)3、7 d的組織塊進行了觀察，發(fā)現(xiàn)用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)的組織塊，細胞游出。而用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的組織塊，組織塊周邊發(fā)現(xiàn)極少量細胞游出生長，后繼續(xù)培養(yǎng)未能繼續(xù)生長。

2.4 不同細胞純化方法對原代培養(yǎng)的影響 使用機械刮除法和反復(fù)貼壁法純化細胞時，成纖維細胞清除效果不好，繼續(xù)培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶中成纖維細胞又可大量生長，再培養(yǎng)一段時間，瓶底滿是成纖維細胞，觀察不到腫瘤細胞的生長。而胰酶消化法純化細胞能收到較好的效果，鑒定后的腫瘤細胞密度相對較高。見圖2。

2.5 培養(yǎng)細胞的鑒定 通過免疫細胞化學(xué)法檢測CEA、CK 20、EMA，證明培養(yǎng)細胞為上皮組織來源。見圖3-5。

圖2 35 d后胰酶消化法純化腫瘤細胞

圖3 CEA染色結(jié)果（×400）

圖4 CK 20染色結(jié)果（×400）

圖5 EMA染色結(jié)果（×400）

3 討論

通過大腸癌原代培養(yǎng)獲得的腫瘤細胞是理想的研究大腸癌腫瘤發(fā)生、發(fā)展機制的載體。但原代培養(yǎng)程序復(fù)雜，無菌要求嚴格，細胞生長受到培養(yǎng)基、操作方法、器械消毒、培養(yǎng)環(huán)境的無菌條件等諸多因素影響。缺乏經(jīng)驗的實驗員進行細胞培養(yǎng)時往往會出現(xiàn)細胞污染率高的情況，而有經(jīng)驗的實驗員往往困擾于細胞的生長活力及純化提取等階段，這其中每一階段都決定著最終實驗的成敗。

3.1 強化無菌操作 無菌操作體現(xiàn)在每一步細微操作中，包括玻璃瓶、培養(yǎng)皿、試管、移液器等的清洗、消毒、保存，培養(yǎng)液的配置，雙抗等試劑的添加等，任何環(huán)節(jié)出現(xiàn)紕漏均會使實驗帶菌，導(dǎo)致培養(yǎng)失敗，而大腸癌新鮮標本又只能做到相對無菌，因此培養(yǎng)基中加入有效抗生素可有效防止污染[4-6]。本實驗中，RPMI 1640培養(yǎng)液含青霉素和鏈霉素，DMEM細胞培養(yǎng)基、Hanks洗液含青霉素、鏈霉素和兩性霉素。且從本實驗結(jié)果看，腫塊增生型腫瘤組織的取材污染率相對較低，我們推測是因為腫塊取材余地大，更容易取得深部、中央部腫瘤組織，所以可以盡量避免接觸腸道細菌導(dǎo)致的污染。

3.2 病理取材的規(guī)范化 無污染、足夠細胞量是進行細胞培養(yǎng)的基本條件。切取標本應(yīng)避免切取脂肪組織及壞死組織，應(yīng)挑選癌細胞集中和細胞活力較好的部位。取材后應(yīng)盡快送檢，不能立即送檢的標本，可將組織塊先放入細胞培養(yǎng)液中，置于冰浴或0～4 ℃冰箱中，以免腫瘤細胞發(fā)生自溶或凋亡。中央部取材腫瘤細胞容易取得壞死物而致培養(yǎng)失敗，但如取得腫塊深部組織則細胞活力好。本研究2例培養(yǎng)出滿意細胞均為腫塊增生型中央深部取材獲得。分化差的腫瘤細胞理論上活力應(yīng)相對較好，而在實踐中，低分化腫瘤細胞短期生長可表現(xiàn)出明顯活力，細胞數(shù)稍多于中分化，但從長期生長結(jié)果來看未發(fā)現(xiàn)細胞數(shù)明顯增多，這可能與離體后細胞環(huán)境改變或營養(yǎng)供給不足等有關(guān)。

3.3 細胞培養(yǎng)方法 目前培養(yǎng)細胞的獲取來源有多種，國外有報道[7]稱移植瘤培養(yǎng)細胞系成功率高于從患者體內(nèi)取得腫瘤細胞的培養(yǎng)方法。培養(yǎng)方法也有多種，國內(nèi)常用的有組織塊培養(yǎng)法[8]和膠原酶消化法[6]。我們的實驗結(jié)果顯示組織塊培養(yǎng)法相對容易獲得成功。組織塊大小適中，換液前靜置，不要讓組織塊滑落漂浮，待組織塊貼壁穩(wěn)定后再補加液體比較重要。培養(yǎng)液最好用營養(yǎng)較高的胎牛血清，濃度高些，加入胰島素或生長激素等促細胞生長因子。

RPMI 1640與DMEM培養(yǎng)基是細胞培養(yǎng)中常用的培養(yǎng)基，孰優(yōu)孰劣并無定論。本實驗對培養(yǎng)3、7 d的組織塊進行了觀察，發(fā)現(xiàn)用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)的組織塊，細胞游出，而用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的組織塊，周邊發(fā)現(xiàn)極少量細胞游出生長，后繼續(xù)培養(yǎng)未能繼續(xù)生長。查閱文獻[9]發(fā)現(xiàn)HCT116、lovo、SW480和colo205等結(jié)腸癌細胞系均使用了RPMI 1640培養(yǎng)基。另外，培養(yǎng)瓶中以生長基質(zhì)包被給腫瘤細胞一定的生長依賴，可以促使其更好地爬出組織塊，鼠尾膠原是不錯的選擇。

3.4 細胞的純化方法 原代培養(yǎng)非常容易受到成纖維細胞的污染，需及時清除。本實驗采用胰酶消化法進行細胞的純化，利用了不同細胞對胰酶的敏感性不同，成纖維細胞首先被消化下來，從而達到純化的目的，鑒定后的腫瘤細胞密度相對較高。與其他細胞純化方法相比，使用胰酶消化法花費少，實驗過程操作簡單。這可能是目前多數(shù)細胞培養(yǎng)實驗選擇胰酶消化法的原因。

綜上，腫瘤細胞的原代培養(yǎng)是非常細致和有難度的基礎(chǔ)工作，本實驗通過不同方法培育出2例細胞數(shù)滿意的大腸癌細胞，并對實驗結(jié)果進行了初步的分析，為繼續(xù)進行細胞培養(yǎng)實驗積累了有益的經(jīng)驗。

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