福辛普利鈉在大鼠腸道的吸收性質(zhì)

孫筱，何璇，黃建耿，李高，斯陸勤 （華中科技大學同濟醫(yī)學院藥學院，湖北 武漢430074）

福辛普利（fosinopril，又名蒙諾 Monopril）為血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI），臨床上常用于治療高血壓和充血性心力衰竭（CHF）。福辛普利幾乎不溶于水，多用其鈉鹽以增加藥物溶解度，但口服生物利用度也僅為32%～36%［1］。有報道，福辛普利是H＋依賴的寡肽轉(zhuǎn)運體 Pept1 （H＋／peptide cotransporter）的底物［2］，Pept1的轉(zhuǎn)運功能可能與其口服吸收密切相關。因此，深入了解福辛普利鈉在大鼠腸道的吸收特性，對其新劑型的開發(fā)和制劑處方設計具有重要意義。本文擬建立測定大鼠腸灌流液中福辛普利鈉含量的HPLC方法，并采用大鼠小腸單向灌流法考察福辛普利鈉在大鼠腸道的吸收特性，探討該藥物吸收與Pept1之間的關系。

1 材料

1．1 儀器 Agilent1100高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Sepu3000工作站（杭州普惠科技有限公司）；TG16 W微量高速離心機（長沙平凡儀器儀表有限公司）；DF－101s集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（河南省予華儀器有限公司）；多通道蠕動泵（德國Petro Gas Ausrüstungen Berlin公司）；DELTA320－pH計（上海梅特勒－托利多有限公司）。

1．2 試劑 福辛普利鈉（武漢圣天宇科技有限公司，純度＞99．6%，批號20101223）；甘氨酰肌氨酸（Gly－Sar，Sigma 公 司，純 度 ＞ 95%，批 號100952752）；烏拉糖（中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司）；乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

1．3 動物 雄性SD大鼠，體質(zhì)量（250±50）g，華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（鄂）2004－0007。

2 方法

2．1 分析方法的建立

2．1．1 色譜條件 色譜柱：Eurospher C18柱（250 mm×4．0mm，5μm），預柱：C18保護柱（25 mm×4．6 mm，10μm），流動相：乙腈－水（30∶70，其中水相含0．3% 三乙胺，pH 值為 2．2）；檢測波長：215 nm，流速：1．0mL·min－1，柱溫：40℃，進樣量：20μL。

2．1．2 方法專屬性 取空白腸灌流液、福辛普利鈉對照品溶液及實際灌流液樣品考察腸液中各成分對福辛普利鈉的測定是否有干擾。

2．1．3 標準曲線 精密稱取福辛普利鈉對照品適量于量瓶中，用甲醇溶解得福辛普利鈉母液（4 mg·mL－1），分別取母液適量用空白腸灌流液稀釋成終濃度為2．5，5，10，20，40，80μg·mL－1的標準曲線樣品，并按“2．2．2”項下所述處理后進行 HPLC分析。以福辛普利鈉濃度C為橫坐標，藥物峰面積A為縱坐標，采用最小二乘法進行回歸計算，得標準曲線方程。

2．1．4 定量下限試驗 福辛普利鈉母液用空白腸灌流液稀釋成終質(zhì)量濃度為2．5μg·mL－1的樣品，并按“2．2．2”項所述平行處理5份樣品，進行HPLC分析，并根據(jù)當日標準曲線計算樣品的測得濃度，計算相對誤差（RE%）。

2．1．5 精密度和回收率試驗 福辛普利鈉母液用空白腸灌流液稀釋成終質(zhì)量濃度分別為5，20，40 μg·mL－1的樣品，各取5份樣品，按“2．2．2”項所述平行處理，連續(xù)測定3 d，以當日標準曲線計算樣品的測得濃度。計算日內(nèi)精密度和日間精密度以及方法回收率和樣品提取回收率。

2．1．6 穩(wěn)定性試驗 福辛普利鈉母液用空白腸灌流液稀釋成終質(zhì)量濃度分別為5，20，40μg·mL－1的樣品，按“2．2．2”項所述平行處理5份樣品。各濃度樣品處理后于室溫放置8 h、置－20℃ 凍存1 d以及37℃ 水浴4 h后分別測定，并根據(jù)當日的標準曲線計算含藥樣品的測得濃度，計算放置前后的相對誤差。

2．2 大鼠小腸在體單向灌流試驗

2．2．1 試驗方法［3－5］大鼠禁食過夜，麻醉后打開腹腔，結(jié)扎膽管，分別在十二指腸、空腸、回腸兩端插管，結(jié)扎。用K－R液（氯化鈉7．0g，葡萄糖1．8 g，碳酸氫鈉1．26 g，磷酸二氫鈉0．234 g，磷酸氫二鈉0．252 g，氯化鉀0．34 g，氯化鎂0．05 g，置1 L量瓶中，純化水溶解并定容至刻度，0．1 mol·L－1鹽酸調(diào)pH值為7．4）配制的藥液平衡腸道30 min后，進口處用己知質(zhì)量的裝有供試液的小瓶灌流、出口處用己知質(zhì)量的小瓶收集流出液，每10 min迅速更換供試、收集小瓶，稱重，計算灌入液和收集液質(zhì)量，試驗共進行90 min，整個試驗過程保持0．25 mL·min－1左右的恒定速度灌流。試驗結(jié)束后，測量并記錄所灌腸段的長度和內(nèi)徑。

試驗考察的分腸段區(qū)間如下：十二指腸段自幽門1 cm處開始，空腸段離幽門15 cm開始，回腸段自盲腸上行20 cm開始，各分腸段均取約10 cm。

2．2．2 灌流樣品的處理方法 取大鼠腸灌流液100μL，加入甲醇200μL，渦混3 min，13 000 r·min－1離心15 min，取上清液進樣測定。

2．2．3 藥物吸附性考察 配制含藥40μg·mL－1的灌流液，同 “2．2．1”項試驗方法但不插管大鼠腸段灌流連接管路2 h，比較灌流前后的藥液濃度，考察試驗管路和玻璃瓶對藥物的吸附性。

2．2．4 腸道滲透系數(shù)Peff計算公式［6－7］依據(jù)下式計算藥物的腸道有效滲透系數(shù)Peff：

其中，Qin為灌流液流入的流速（mL·s－1），Cout和Cin分別為腸道流出液、流入液的質(zhì)量濃度（μg·mL－1），S為灌流腸段的內(nèi)表面積（cm2），Vin和Vout分別為流入和流出的灌流液體積（mL），L為實驗腸段的長度（cm），R為腸段半徑（cm）。

2．3 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)均以±s表示。通過SPSS軟件，多組間的比較采用ANOVA單因素方差分析；對兩組間的比較采用雙尾不配對的Student’st檢驗。P＜0．05時，認為差異有顯著性。

3 結(jié)果

3．1 HPLC方法的建立

3．1．1 方法專屬性試驗 圖1結(jié)果顯示藥物峰形良好，無腸液內(nèi)源性物質(zhì)的干擾。

圖1 福辛普利鈉HPLC專屬性考察圖譜Fig 1 HPLC specificity chromatograms of fosinopril sodium

3．1．2 線性關系考察 福辛普利鈉的線性回歸方程為Y＝9 440．7X－13 513，r＝0．999 2，福辛普利鈉在2．5～80μg·mL－1范圍內(nèi)線性良好。

3．1．3 定量下限 福辛普利鈉在定量下限為2．5 μg·mL－1時RSD小于5%，RE＜15%。

3．1．4 精密度及回收率 福辛普利鈉低、中、高濃度樣品的日內(nèi)精密度RSD值均小于3%，日間精密度RSD值均小于9%，低、中、高3個濃度的樣品方法回收率分別為 92．39%、96．58%、102．10%，提取回收率分別為 94．15%、97．19%、103．20%。見表1和表2。

3．1．5 穩(wěn)定性 低、中、高濃度的樣品處理后室溫放置8 h、未處理樣品 －20℃ 凍存1 d、37℃ 水浴4 h后藥物均無顯著變化，可準確測定。見表3。

表1 福辛普利鈉精密度試驗結(jié)果Tab 1 Results of precision test of fosinopril sodium

表2 福辛普利鈉的回收率試驗結(jié)果（n＝5）Tab 2 Recovery rate of fosinopril sodium（n＝5）

3．2 藥物吸附性考察 灌流管路2 h后藥物濃度為初始濃度的（101．1±2．0）%，表明試驗管路和小瓶對藥物無吸附作用。

3．3 福辛普利鈉在大鼠不同腸段的吸收 用空白K－R液（pH7．4）配制40μg·mL－1的含藥灌流液，按照“2．2．1”項下方法進行灌流，福辛普利鈉在十二指腸、空腸和回腸的有效滲透系數(shù)Peff（×10－4cm·s－1，n＝6）分 別為 （1．5±0．4）、（1．15±0．26）和（0．91±0．14），且空腸和回腸與十二指腸之間差異均存在顯著性（P＜0．05）。

3．4 灌流液pH值對福辛普利鈉腸道吸收的影響分別配制pH 值為7．4，6．6，5．6的含藥溶液進行灌流，結(jié)果見圖2。福辛普利鈉在不同腸段的滲透系數(shù)隨灌流液pH值下降而增加；當pH值為5．6時，藥物在各腸段的吸收與福辛普利鈉在pH7．4時相比差異均有顯著性（P＜0．05）。

3．5 不同濃度Gly－Sar對福辛普利鈉腸道吸收的影響 Pept1的典型底物Gly－Sar對福辛普利鈉腸道吸收的影響見圖3。當二肽濃度為0．144 mmol·L－1時，對藥物在十二指腸的吸收有極顯著性促進作用（P＜0．01），但如進一步提高二肽濃度，則藥物的吸收呈下降趨勢，當濃度為3．59 mmol·L－1時，三段腸對藥物的吸收與0．072 mmol·L－1或0．144 mmol·L－1時相比均出現(xiàn)顯著性差異（P＜0．05）。

表3 福辛普利鈉穩(wěn)定性試驗（n＝5）Tab 3 Stability of fosinopril sodium（n＝5）

4 討論

由于福辛普利鈉的最大紫外吸收處于較低波長處，其生物樣品的測定易受內(nèi)源性雜質(zhì)的干擾。在預試驗中發(fā)現(xiàn)，腸灌流液樣品采用甲醇沉淀蛋白后雜質(zhì)峰可明顯少于乙腈；降低流動相的pH值可顯著改善峰型，但同時會使雜質(zhì)峰增加；此外，加入適量的三乙胺也可顯著改善藥物峰型。采用本文所建立的HPLC條件對福辛普利鈉大鼠腸灌流液進行測定，其方法簡單、靈敏、可靠，精密度、準確度和穩(wěn)定性均可滿足生物樣品測定的要求。

福辛普利鈉在大鼠近端小腸的吸收明顯高于遠端，這與Pept1在大鼠小腸的分布密度從小腸近端至小腸遠端逐漸降低的報道相一致［8－9］。隨著灌流液pH值的降低，藥物在大鼠各腸段的有效滲透系數(shù)均呈增大趨勢，且pH值越低增加越顯著，這可能是因為Pept1是一種H＋同向協(xié)同的寡肽轉(zhuǎn)運蛋白［10］，pH值的降低可為Pept1提供更多的 H＋，從而促進了Pept1的轉(zhuǎn)運功能。Gly－Sar是Pept1的專屬性底物，本研究結(jié)果表明Gly－Sar對福辛普利鈉的吸收呈現(xiàn)隨濃度增加先促進后抑制的趨勢。低濃度的二肽具有促進福辛普利鈉的腸道吸收的作用，此現(xiàn)象可能與Gly－Sar促進細胞頂膜的Pept1肽轉(zhuǎn)運體蛋白表達，從而增加福辛普利鈉的腸道轉(zhuǎn)運有關。在Shiraga等［11］進行的研究中發(fā)現(xiàn)二肽可與Pept1基因啟動子上的氨基酸敏感因子之間產(chǎn)生相互作用，提高Pept1 mRNA的轉(zhuǎn)錄活性，從而上調(diào)Pept1的蛋白表達。Walker等［12］在采用Gly－Sar處理Caco－2細胞24 h后，經(jīng) Western印跡法分析也發(fā)現(xiàn)Pept1的蛋白表達水平增加了近2倍。但當二肽濃度進一步增大時，二肽則可能與福辛普利鈉共同競爭Pept1轉(zhuǎn)運體的轉(zhuǎn)運位點，從而使底物藥物的吸收減少。雖然Gly－Sar對福辛普利鈉腸道吸收影響的分子機制還有待進一步的研究進行確證，但通過本文的研究可見影響Pept1活性的因素均可能會使福辛普利鈉的腸道吸收發(fā)生變化，福辛普利鈉在大鼠腸道的吸收易受到Pept1的表達豐度、腸腔pH值以及其他Pept1底物的影響。

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