TLC－Raman聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)部分頭孢菌素類(lèi)藥物

許鳳，李紅梅，王樂(lè)平 （齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾161006）

頭孢菌素類(lèi)藥物是臨床上應(yīng)用較廣泛的抗菌類(lèi)藥物，其中頭孢替唑鈉為第一代半合成的頭孢菌素衍生物，頭孢羥氨芐為半合成第一代口服頭孢菌素，頭孢呋辛鈉為第2代頭孢菌素類(lèi)抗生素，頭孢他啶為第3代頭孢菌素類(lèi)抗生素，均收載于中國(guó)藥典2010年版二部，目前這四種頭孢菌素類(lèi)藥物市面上出現(xiàn)假藥較多，為了維護(hù)消費(fèi)者權(quán)益，保護(hù)人民的生命安全，本文建立了能同時(shí)檢測(cè)頭孢他啶、頭孢替唑鈉、頭孢呋辛鈉和頭孢羥氨芐這4種藥品的薄層（TLC）快速藥檢分析方法，并與拉曼光譜圖法（Raman）聯(lián)用，效果較理想。

1 材料

1．1 儀器 UP50超聲波清洗器（南京壘君達(dá)超聲電子設(shè)備有限公司）；YOKO－ZF三用紫外線(xiàn)分析儀（武漢藥科新技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）；拉曼光譜儀NICOLET6700FT－IR NXR FTRAMAN MODULE（Thermo SCIENTIFIC）。

1．2 試藥 注射用頭孢他啶（上海新先鋒藥業(yè)有限公司，批號(hào)120313）；注射用頭孢他啶（上海新先鋒藥業(yè)有限公司，批號(hào)110701）；注射用頭孢替唑鈉（天津新豐制藥有限公司，批號(hào)110801）；注射用頭孢替唑鈉（天津新豐制藥有限公司，批號(hào)111201）；注射用頭孢呋辛鈉（深圳致君制藥有限公司，批號(hào)B20111001）；注射用頭孢呋辛鈉（深圳致君制藥有限公司，批號(hào)B20111008）；頭孢羥氨芐片（石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司，批號(hào)003101201）；頭孢羥氨芐顆粒（石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司；批號(hào)064110150）。頭孢他啶、頭孢替唑鈉、頭孢呋辛鈉、頭孢羥氨芐等對(duì)照品均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；薄層層析硅膠GF254、羧甲基纖維素鈉、檸檬酸鈉、硝酸銀、醋酸乙酯、冰醋酸、丙酮、氨水、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉均為分析純。

2 方法

2．1 TLC法

2．1．1 溶液的配制 （1）對(duì)照品溶液：稱(chēng)取頭孢他啶、頭孢替唑鈉、頭孢呋辛鈉和頭孢羥氨芐對(duì)照品各適量于不同的容量瓶中，分別加pH7．0磷酸鹽緩沖液［1］溶解制成每1 mL約含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。再稱(chēng)取頭孢他啶、頭孢替唑鈉、頭孢呋辛鈉和頭孢羥氨芐對(duì)照品各適量置于同一量瓶中，加pH7．0磷酸鹽緩沖液溶解制成每1 mL各約含1 mg的溶液，作為對(duì)照品混合溶液。（2）供試品溶液：稱(chēng)取頭孢他啶、頭孢替唑鈉、頭孢呋辛鈉和頭孢羥氨芐4個(gè)品種8個(gè)批次的藥品各適量置于不同量瓶中，加pH7．0磷酸鹽緩沖液溶解、振搖2 min后超聲提取5 min，按標(biāo)示量制成每1 mL約含1 mg的溶液，作為供試品溶液。

2．1．2 色譜條件 固定相：硅膠 GF254－0．5%羧甲基纖維素鈉溶液（1∶3）研勻，濕法鋪板，晾干，105℃活化1 h后置干燥器中備用；展開(kāi)劑：醋酸乙酯－冰醋酸－丙酮－水＝5∶2∶2∶1＋適量氨水作為掃尾劑；點(diǎn)樣量：2μL；顯色方法：于254 nm紫外燈下檢視。

2．1．3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 依法［2］，將4種對(duì)照品溶液與對(duì)照品混合溶液各點(diǎn)樣2μL于同一硅膠GF254薄層板上，飽和5～10 min后展開(kāi)約20 min、展距約6～7 cm時(shí)分離效果較理想。將硅膠板取出晾干，于254 nm紫外燈下檢視，結(jié)果如圖1所示。

2．1．4 耐用性考查 在不同條件下，將對(duì)照品混合溶液作為考察對(duì)象，點(diǎn)樣量為2μL，測(cè)定方法同上，考察15，25，35，45，55℃等溫度和18%，32%，58%和88%等濕度對(duì)本展開(kāi)系統(tǒng)是否有影響。最終結(jié)果顯示溫度和濕度的變化對(duì)本展開(kāi)系統(tǒng)無(wú)影響，分離度及比移值均很理想。

2．1．5 測(cè)定 在“2．1．2”項(xiàng)的色譜條件下，在同一 GF245玻璃硅膠板上依次點(diǎn)對(duì)照品混合溶液、頭孢他啶、頭孢替唑鈉、頭孢呋辛鈉和頭孢羥氨芐等4個(gè)品種8個(gè)批次藥品的供試品溶液各2μL，在層析缸中飽和5～10 min，展開(kāi)20 min后，在254 nm下檢視，結(jié)果如圖2所示。

2．2 Raman法驗(yàn)證

2．2．1 掃描條件 FTIR掃描范圍：400～4000 cm－1；拉曼光譜儀激光源：1064 nm，拉曼位移波數(shù)范圍：100～3750 cm－1，掃描次數(shù)：32次，分辨率：8 cm－1。

2．2．2 測(cè)定 在圖2～圖5中的薄層板上的對(duì)照品斑點(diǎn)處與相應(yīng)樣品的斑點(diǎn)處點(diǎn)上自制的納米銀溶膠［3］，在“2．2．1”的掃描條件下進(jìn)行Raman掃描，部分結(jié)果如圖6～9。

3 結(jié)果

3．1 TLC法結(jié)果

3．1．1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 將展開(kāi)、晾干后的GF254硅膠板在紫外燈254 nm下檢視，結(jié)果如圖1所示，4點(diǎn)分離很好，比移值Rf0．2～0．8，也很理想。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)TLC圖Fig 1 TLC chromatograph of system suitability test

3．1．2 供試品測(cè)定結(jié)果 如圖2所示，頭孢羥氨芐顆粒劑斑點(diǎn)有拖尾現(xiàn)象，其產(chǎn)生原因主要是因?yàn)轭w粒劑中輔料較多，除常用的稀釋劑，潤(rùn)滑劑外還添加糖類(lèi)做矯味劑，這些添加可能影響頭孢羥氨芐的展開(kāi)，使其斑點(diǎn)拖尾。

根據(jù)圖2中Rf值和斑點(diǎn)顏色能夠初步判定所檢測(cè)的頭孢他啶、頭孢替唑鈉、頭孢呋辛鈉和頭孢羥氨芐等4個(gè)品種8個(gè)批次的藥品都為正品。

圖2 供試品TLC圖Fig 2 TLC chromatograph of ceftazidine samples

3．2 Raman法結(jié)果

圖3 頭孢他啶Raman圖Fig 3 Raman spectrum of ceftazidine

圖4 頭孢替唑鈉Raman圖Fig 4 Raman spectrum of ceftezole sodium

圖5 頭孢呋辛鈉Raman圖Fig 5 Raman spectrum of cefuroxime sodium

圖6 頭孢羥氨芐Raman圖Fig 6 Raman spectrum of cefuroxime sodium

根據(jù)Raman圖能夠判定所檢測(cè)的頭孢他啶、頭孢替唑鈉、頭孢呋辛鈉、頭孢羥氨芐等4個(gè)品種8個(gè)批次的藥品都為正品，此結(jié)果與TLC檢測(cè)結(jié)果相符。

4 討論

頭孢菌素類(lèi)抗生素是分子中含有頭孢烯的半合成抗生素。中國(guó)藥典2010年版二部中收載的頭孢菌素類(lèi)藥物制劑主要用化學(xué)法和HPLC法進(jìn)行鑒別，都存在專(zhuān)屬性不高的缺點(diǎn)。而現(xiàn)有文獻(xiàn)所介紹的TLC法［4－6］固定相使用的是硅膠G或H、需要噴以顯色劑方可顯色，方法繁瑣費(fèi)時(shí)。在本研究中，因考慮到頭孢菌素類(lèi)藥物結(jié)構(gòu)中有共軛結(jié)構(gòu)對(duì)紫外光有吸收，所以選用了硅膠GF254為固定相，在紫外燈254 nm下檢視即可，方便省時(shí)。

因頭孢菌素類(lèi)藥物分子結(jié)構(gòu)非常相似，通常一個(gè)展開(kāi)系統(tǒng)只能展開(kāi)一種此類(lèi)藥物，欲將幾種此類(lèi)藥物區(qū)分開(kāi)來(lái)，在固定相確定后，流動(dòng)相的選擇至關(guān)重要。而現(xiàn)有文獻(xiàn)所介紹的TLC法［1］流動(dòng)相中使用了較大比例（70%）的四氫呋喃，雖然分離效果較理想，但因四氫呋喃為二類(lèi)有毒試劑，對(duì)環(huán)境和人體傷害較大，本研究選用了毒性較小的醋酸乙酯∶冰醋酸∶丙酮∶水＝5∶2∶2∶1＋適量氨水為展開(kāi)劑，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知此TLC系統(tǒng)可同時(shí)檢測(cè)頭孢他啶、頭孢替唑鈉、頭孢呋辛鈉和頭孢羥氨芐4種藥物且展開(kāi)速度較快，適用于基層藥品檢驗(yàn)。

以上TLC方法專(zhuān)屬性仍不是很高，可用于該類(lèi)藥品的初篩，其結(jié)果需要做進(jìn)一步分析驗(yàn)證。作為一種近年來(lái)發(fā)展迅速的光譜分析方法，拉曼光譜在某些方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。使用拉曼光譜對(duì)樣品進(jìn)行分析，具有測(cè)試樣品非接觸性、非破壞性、時(shí)間短、樣品所需量小及樣品無(wú)需制備等優(yōu)點(diǎn)［7－8］。拉曼光譜法專(zhuān)屬性雖然很高，但對(duì)物質(zhì)的純度要求也較高，若為制劑，則輔料會(huì)對(duì)主成分的Raman光譜產(chǎn)生干擾，不利于主成分的識(shí)別［9］。而文獻(xiàn)報(bào)道的薄層色譜制備技術(shù)［10］操作較繁瑣，不利于基層快檢。本研究在展開(kāi)的薄層板上的對(duì)照品與對(duì)應(yīng)樣品的斑點(diǎn)處點(diǎn)上自制的納米銀溶膠以增強(qiáng)Raman響應(yīng)信號(hào)［11］，再進(jìn)行Raman掃描，既利用了TLC法分離的優(yōu)勢(shì)，又利用了Raman專(zhuān)屬性高的特點(diǎn)，簡(jiǎn)便、快速。由檢測(cè)結(jié)果可知Raman法適用于該類(lèi)藥物的定性鑒別。本研究不僅可以用于該頭孢類(lèi)藥品的鑒別，而且將會(huì)在中藥保健品中非法添加西藥的鑒別方面有較大的發(fā)展空間。

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