rAAV－h(huán)BMP7的包裝純化及感染滴度的測(cè)定※

西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院 （西安710004） 石建峰 饒國(guó)洲 魏 虹 張 晨 李 昂

骨形成蛋白（BMPs）是一類(lèi)具有多種功能的生長(zhǎng)因子，屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族，具有明顯促成骨作用的細(xì)胞因子，參與機(jī)體胚胎發(fā)育、骨骼形成及組織器官發(fā)生等生命過(guò)程。人骨形成蛋白7（Human bone morphogenetic protein－7，hBMP7）是其中促成骨作用較強(qiáng)的一個(gè)成員，具有較強(qiáng)的骨誘導(dǎo)能力及維持軟骨細(xì)胞的表型、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)如蛋白多糖和Ⅱ型膠原的合成、促進(jìn)有成骨作用的細(xì)胞分化等能力，在體內(nèi)外均能誘導(dǎo)形成骨組織、牙本質(zhì)，不僅可實(shí)現(xiàn)牙槽骨的再生，還可明顯提高牙骨質(zhì)再生量，是組織工程技術(shù)常用的一種細(xì)胞因子［1］。

基因轉(zhuǎn)移載體的選擇，決定著治療基因能否進(jìn)入種子細(xì)胞并實(shí)現(xiàn)有效表達(dá)，是基因治療和組織工程技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。重組腺相關(guān)病毒［2］（Recombinant adeno－associated virus carrierr，rAAV）宿主范圍廣，既能感染分裂期細(xì)胞也能感染非分裂期細(xì)胞；能將其基因組DNA定點(diǎn)整合到宿主細(xì)胞染色體上，使攜帶的外源基因在宿主體內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)，且不引起宿主基因突變。以rAAV為基礎(chǔ)構(gòu)建的病毒載體，已經(jīng)在科學(xué)研究領(lǐng)域及多種疾病的基因治療方面得到了廣泛的應(yīng)用。

本組擬利用前期構(gòu)建并鑒定正確的腺相關(guān)病毒載體pAAVIRES－h(huán)rGFP－h(huán)BMP7［3］，應(yīng)用 AAV Helper－Free System、磷酸鈣三質(zhì)粒共沉淀法，在AAV－293細(xì)胞內(nèi)包裝具有感染性的腺相關(guān)病毒rAAV－h(huán)BMP7，按氯仿處理、PEG／NaCL沉淀的方法濃縮純化；并測(cè)定其包裝效率及感染AAV－HT1080細(xì)胞后的感染效率和滴度，為組織工程技術(shù)治療牙周組織缺損做基礎(chǔ)性研究。

材料與方法

1 試驗(yàn)材料 AAV Helper－Free System、AAV－293細(xì)胞、AAV－HT1080細(xì)胞、pAAV－GFP質(zhì)粒、胎牛血清、L－DMEM 培養(yǎng)基、H－DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Stratagene公司；高純度質(zhì)粒大提試劑盒購(gòu)自北京TIANGEN公司；磷酸鈣法細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒、β－半乳糖苷酶原位染色試劑盒購(gòu)自碧云天（Beyotime）公司；氨芐青霉素、鏈霉素購(gòu)自北京奧科；其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2．1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 制備含 Amp（50μg／m1）的LB固體平板，流水下快速解凍DH5α感受態(tài)細(xì)胞，加入1 μl pAAVIRES－h(huán)rGFP－h(huán)BMP7質(zhì)粒，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，冰浴30min；42℃熱休克90s；冰浴2min，加入預(yù)熱至37℃的LB液體培養(yǎng)基400μl，37℃，搖床轉(zhuǎn)速＜50r／min溫育45min，使細(xì)胞復(fù)蘇并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗性基因；取100μl菌液涂于含X－gal和IPTG的瓊脂平皿，于37℃培養(yǎng)16～18h；終止培養(yǎng)后，將平板置4℃冰箱1～4h，使藍(lán)白斑篩選實(shí)驗(yàn)充分顯色。同法對(duì)輔助質(zhì)粒pAAV－Helper和包裝質(zhì)粒pAAV－RC進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

2．2 質(zhì)粒大量提取及濃度和純度測(cè)定 每種質(zhì)粒隨機(jī)挑取3個(gè)轉(zhuǎn)化陽(yáng)性克?。ò咨寺。?，各加入到5 ml LB液體培養(yǎng)基中（含 Amp 50μg／ml），37℃、225 r／min震蕩培養(yǎng)3h，分別加入到裝有250ml LB液體培養(yǎng)基（含 Amp 50μg／ml）的500ml三角燒瓶中，37℃、225r／min震蕩培養(yǎng)過(guò)夜，測(cè)A600處OD值＞0．60，質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒，進(jìn)行濃度和純度測(cè)定。用BamHI／SalI雙酶切鑒定重組病毒質(zhì)粒pAAVIRES－h(huán)rGFP－h(huán)BMP7。

2．3 AAV－293細(xì)胞培養(yǎng) 在37℃水浴中快速解凍AAV－293細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到裝有10mlDMEM培養(yǎng)液的錐底離心管中，室溫下以200g的速度離心3min吸除上清液，重新加入5ml新鮮DMEM輕輕吹打重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到一個(gè)裝有10mlDMEM（氨芐青霉素100U／ml和鏈霉素100μg／ml）的75cm的組織培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)至50%融合時(shí)傳代培養(yǎng)。

2．4 三質(zhì)粒共沉淀法AAV－293細(xì)胞包裝rAAV－h(huán)BMP7 將AAV－293細(xì)胞種植于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，3×105／孔，培養(yǎng)至70～80%融合。采用AAV Helper－Free System／磷酸鈣三質(zhì)粒共沉淀法轉(zhuǎn)染AAV－293細(xì)胞（以下為每孔加液量）。轉(zhuǎn)染前30～60min，吸去培養(yǎng)液，加入新鮮的不含抗生素的DMEM完全培養(yǎng)液4ml。分別取純度1．80以上的pAAV－Helper、pAAVIRES－h(huán)rGFP－h(huán)BMP7 和 pAAV－RC 各 10μl（1μg／μl），加入到 100μl氯化鈣溶液中混勻，對(duì)照組以pAAV－GFP代替病毒質(zhì)粒。把DNA－氯化鈣溶液加入到100μl BBS溶液中混勻，室溫孵育20min均勻滴加到整個(gè)孔內(nèi)。實(shí)驗(yàn)組10孔，對(duì)照組1孔，陰性對(duì)照1孔／板。37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12h后輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板數(shù)次，吸去含磷酸鈣沉淀的培養(yǎng)液，加入2ml新鮮的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72h，收集細(xì)胞，期間倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及熒光表達(dá)情況。

病毒包裝完成后，取平行對(duì)照rAAV－GFP組細(xì)胞培養(yǎng)皿，倒置熒光顯微鏡下隨機(jī)選取高倍視野下（400×）10個(gè)視野，計(jì)數(shù)視野內(nèi)表達(dá)熒光細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞總數(shù)計(jì)算rAAV－h(huán)BMP7的包裝效率。

2．5 病毒液的收集和純化 用細(xì)胞刮刀把貼壁細(xì)胞全部刮落到培養(yǎng)液中，轉(zhuǎn)移到一消毒、預(yù)冷的50ml離心管中，反復(fù)凍融四次（干冰浴和37℃水浴），每次凍和融的時(shí)間為10min左右。每次融化后輕輕漩渦振蕩離心管。12000r／min離心10min除去細(xì)胞碎片。將含病毒的上清轉(zhuǎn)入一新的試管中。

向病毒液中（40ml）加入1／10體積的氯仿，37℃，300rpm／min劇烈振搖1h。加入固體氯化鈉2．56g至終濃度為1mol／L，4℃、12000r／min離心30min，收集上清于一新的50ml離心管中，加入PEG8000 4．5g至終濃度10%，劇烈振搖直至完全溶解，冰浴1h。4℃，12000r／min離心30min棄上清，4ml PBS溶解沉淀，以每份0．5ml分裝在1．5ml EP管中，–80℃保存。命名為rAAV hBMP7。

2．6 rAAV hBMP7感染 AAV－HT1080細(xì)胞將AAV－HT1080細(xì)胞復(fù)蘇及傳代培養(yǎng)（方法和步驟同AAV－293細(xì)胞的復(fù)蘇與傳代）。用L－DMEM調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1．5×105／ml，種植于12孔培養(yǎng)板，每孔1ml，37℃培養(yǎng)至70%融合。每孔加0．2ml AAV Permissive Growth Medium，（保留最初的培養(yǎng)液），漩渦振蕩混合細(xì)胞，37℃孵育5～6h 吸除孔內(nèi)液體，用37℃預(yù)溫的L－DMEM 洗滌細(xì)胞1次。用L－DMEM將純化的病毒原液0．1ml按10×的濃度梯度稀釋為10－2，10－3，10－4，10－5，10－6。分別加入各培養(yǎng)孔，每濃度組設(shè)3孔，每孔0．5ml，在37℃孵育培養(yǎng)板2h，其間每30min輕輕漩渦振蕩培養(yǎng)板幾次。各加0．5ml預(yù)溫的H－DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)48h。期間倒置顯微鏡和熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及熒光表達(dá)情況。

2．7 β－半乳糖苷酶染色法測(cè)定rAAV hBMP7感染效率和滴度 AAV－HT1080細(xì)胞培養(yǎng)至48h，吸出培養(yǎng)液，用L－DMEM洗滌細(xì)胞一次，原位β－半乳糖苷酶染色試劑盒固定并染色細(xì)胞。每孔加0．5mlβ－半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定10min；吸除固定液，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次3min；每孔加入0．5ml染色工作液（10μlβ－半乳糖苷酶染色液 A ＋10μlβ－半乳糖苷酶染色液B＋930μlβ－半乳糖苷酶染色液C＋X－Gal溶液50μl）；37℃孵育20min至2h，直至部分細(xì)胞顏色變藍(lán)。顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)一定細(xì)胞中藍(lán)色細(xì)胞的個(gè)數(shù)，計(jì)算rAAV hBMP7感染效率，感染效率＝染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)／計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)×100%，并估算病毒原液感染滴度。

結(jié) 果

1 質(zhì)粒濃度和純度 提取的pAAVIRES－h(huán)rGFP－h(huán)BMP7質(zhì)粒，經(jīng)紫外分光光度儀檢測(cè)，在260nm處OD值為0．56，OD260／OD280＝1．79；OD260值為1．0相當(dāng)于大約50μg／ml雙鏈DNA，質(zhì)粒稀釋倍數(shù)為40，計(jì)算得質(zhì)粒濃度為1．12mg／ml（1．12μg／μl）。同法計(jì)算包裝質(zhì)粒pAAV－RC的濃度為1．08μg／μl，純度為1．81；輔助質(zhì)粒pAAV－Helper濃度為1．22μg／μl，純度為1．82，純度和濃度均符合后繼實(shí)驗(yàn)要求。

2 pAAVIRES－h(huán)rGFP－h(huán)BMP7雙 酶切 鑒 定 用BamHI／SalI雙酶切重組病毒質(zhì)粒pAAVIRES－h(huán)rG FP－h(huán)BMP71．2%瓊脂糖凝膠電泳圖譜顯示6100bp和1300bp區(qū)域有兩條DNA條帶（見(jiàn)圖1），與病毒載體 質(zhì) 粒 pAAVIRES－h(huán)rGFP（6．1Kb）及 目 的 基 因hBMP7（1296bp）大小一致。雙酶切圖譜說(shuō)明所提質(zhì)粒為前期構(gòu)建并鑒定的質(zhì)粒pAAVIRES－h(huán)rGFP－h(huán)BMP7。

3 rAAV hBMP7在293細(xì)胞內(nèi)的包裝

3．1 包裝6h細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和熒光表達(dá)情況 病毒包裝6h后，倒置顯微鏡低倍下觀察可見(jiàn)rAAVGFP組、rAAV－h(huán)BMP7組AAV－293細(xì)胞形態(tài)正常、生長(zhǎng)狀態(tài)良好。提示磷酸鈣共沉淀物對(duì)AAV－293細(xì)胞生長(zhǎng)干擾較小，底部可見(jiàn)少量細(xì)小的顆粒，為殘余的磷酸鈣共沉淀物；高倍鏡下觀察AAV－293可見(jiàn)細(xì)胞漿中含有較多極細(xì)小的磷酸鈣顆粒（見(jiàn)圖2）。倒置熒光顯微鏡觀察，陰性組無(wú)熒光，rAAV－GFP組和rAAV－h(huán)BMP7組均出現(xiàn)熒光表達(dá)，以對(duì)照rAAV－GFP組為明顯（見(jiàn)圖3）。提示病毒在293細(xì)胞內(nèi)已經(jīng)獲得“拯救”、包裝，并隨細(xì)胞的分裂而復(fù)制，報(bào)告基因也已經(jīng)開(kāi)始表達(dá)。

圖1 質(zhì)粒pAAVIRES－h(huán)rGFP－h(huán)BMP7雙酶切圖M：DNA MakerⅥ，1：BamHI／SalI 雙酶切

圖2 包裝6h后AAV－GFP組倒置顯微鏡下AAV－293細(xì)胞表型變化（A：100×；B：400×）

圖3 包裝12h后AAV－GFP組熒光表達(dá)（A：普通倒置顯微鏡；B：倒置熒光顯微鏡；400×）

3．2 包裝72h觀察 陰性組始終無(wú)熒光發(fā)出（圖4A，D），隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，rAAV－GFP組（見(jiàn)圖4 B，E）和rAAV－h(huán)BMP7（見(jiàn)圖4C，F(xiàn)）組培養(yǎng)基顏色逐漸變?yōu)樽攸S色，板底細(xì)胞表面有沉淀物形成，上清中也有大量絮狀物出現(xiàn)，細(xì)胞形態(tài)變的不規(guī)則，有相互融合的趨勢(shì)。兩組細(xì)胞表達(dá)熒光的細(xì)胞數(shù)量及熒光強(qiáng)度也隨包裝時(shí)間延長(zhǎng)而增加，72h時(shí)絕大多數(shù)細(xì)胞都發(fā)熒光。各組細(xì)胞同一視野下形態(tài)結(jié)構(gòu)及熒光表達(dá)情況見(jiàn)圖4。

3．3 包裝效率 病毒包裝完成后，取平行對(duì)照rAAV－GFP組細(xì)胞培養(yǎng)皿，倒置熒光顯微鏡下隨機(jī)選取高倍視野下（400×）10個(gè)視野，計(jì)數(shù)視野內(nèi)表達(dá)熒光細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞總數(shù)，取平均值計(jì)算rAAV－h(huán)BMP7包裝效率為94．16±0．13%。

圖4 包裝72h倒置顯微鏡下AAV－293細(xì)胞表型變化及倒置熒光顯微鏡下GFP表達(dá)

4 rAAV－h(huán)BMP7感染AAV－HT1080細(xì)胞熒光表達(dá) 純化的rAAV－h(huán)BMP7各濃度組感染AAVHT1080細(xì)胞后，12h左右均有表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞出現(xiàn)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，高濃度組細(xì)胞從培養(yǎng)板底面脫離，細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，相互融合，熒光表達(dá)也融合成片，繼續(xù)培養(yǎng)則熒光表達(dá)下降；低濃度組細(xì)胞界限清晰，結(jié)構(gòu)較正常，細(xì)胞損傷輕微，熒光表達(dá)清晰持久（見(jiàn)圖5），6～7d達(dá)到高峰。

5 原位β－半乳糖苷酶染色法測(cè)定rAAV hBMP7感染效率和病毒滴度 rAAV－h(huán)BMP7轉(zhuǎn)染易感細(xì)胞AAV－HT1080后，病毒復(fù)制，病毒載體上的β－半乳糖苷酶基因表達(dá)，催化底物X－Gal顯色，細(xì)胞被藍(lán)染。選擇細(xì)胞形態(tài)保持較完整、數(shù)量適中（10＜n＜100）的濃度組，光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)10不同視野中的藍(lán)染細(xì)胞數(shù)，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率：鏡下觀察發(fā)現(xiàn)10－5，10－6兩個(gè)組細(xì)胞形態(tài)完整（見(jiàn)圖6A），界限清晰；其他組別細(xì)胞形態(tài)損傷嚴(yán)重，細(xì)胞邊緣模糊、破裂相互融合（見(jiàn)圖6B），提示病毒顆粒過(guò)多，細(xì)胞發(fā)生毒性改變。計(jì)算轉(zhuǎn)染效率10－5組約為78%；10－6組約為35%。參照細(xì)胞形態(tài)變化情況可以確定，實(shí)驗(yàn)獲得的rAAV－h(huán)BMP7作10－5稀釋可以獲得78%的較好轉(zhuǎn)染效率；以該組別轉(zhuǎn)染效率推算病毒感染滴度：種植細(xì)胞數(shù)／ml×感染效率×病毒實(shí)際稀釋倍數(shù)（1／稀釋用量0．1ml÷稀釋后濃度值10－5÷每孔病毒用量0．5ml），rAAV hBMP7的滴度約為2．34×1011v·g／ml，可用于后繼實(shí)驗(yàn)。

圖5 rAAV－h(huán)BMP7（10－5 組）感染 AAV－HT1080細(xì)胞72h后熒光表達(dá)（A：倒置顯微鏡；B：倒置熒光顯微鏡；×100）

圖6 原位β－半乳糖苷酶染色結(jié)果（200×）

討 論

骨形成蛋白（BMPs）存在于骨、牙本質(zhì)等多種組織中，對(duì)骨組織的發(fā)育和修復(fù)重建起著關(guān)鍵性作用，BMP7是BMPs家族中促成骨能力最強(qiáng)的生長(zhǎng)因子之一［4］。研究發(fā)現(xiàn)BMP7誘導(dǎo)新骨形成，一般是通過(guò)三步多分子級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)來(lái)產(chǎn)生成骨效應(yīng)［5］。①誘導(dǎo)細(xì)胞趨化，促進(jìn)特定的細(xì)胞群發(fā)生方向性趨化，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞黏附和增殖；②誘導(dǎo)和促進(jìn)有絲分裂；③誘導(dǎo)細(xì)胞分化，BMP－7能夠誘導(dǎo)多種細(xì)胞向成骨型細(xì)胞分化，促進(jìn)細(xì)胞基質(zhì)合成，I型、II型膠原、ALP、骨鈣素等的基因表達(dá)升高。

在口腔領(lǐng)域，許多學(xué)者嘗試將BMP7或BMP7復(fù)合其它因子用于牙周組織工程中，刺激牙周膜中的潛在細(xì)胞群分化增殖，促進(jìn)牙周和頜面部組織缺損的修復(fù)與重建。Jin等［6］利用BMP－7基因修飾的皮膚成纖維細(xì)胞，附合凝膠載體支架，修復(fù)小鼠下頜牙槽骨缺損的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染組小鼠在骨缺損部位有軟骨的快速形成，繼而形成骨及牙骨質(zhì)。Yeh［7］等的研究發(fā)現(xiàn)，BMP7能促進(jìn)分化的成骨細(xì)胞高表達(dá)骨鈣素及堿性磷酸酶，誘導(dǎo)形成鈣化結(jié)節(jié)，細(xì)胞成骨活性增強(qiáng)。證實(shí)了rhBMP－7的促成骨特性。本課題應(yīng)用前期構(gòu)建并鑒定的pAAVIRES－h(huán)rGFP－h(huán)BMP7質(zhì)粒，制備有感染性的rAAV病毒，以期獲得hBMP7在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，為牙周組織缺損的治療做基礎(chǔ)性研究。

腺相關(guān)病毒載體具有能在人類(lèi)染色體定點(diǎn)整合、長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)而無(wú)致癌隱患，轉(zhuǎn)染效率高而免疫原性低等優(yōu)點(diǎn)，是近年來(lái)研究和應(yīng)用最廣的一種病毒類(lèi)載體［8］。Kunze等［9］比較了1～5型AAV 對(duì)牙周膜細(xì)胞、牙齦細(xì)胞感染效率的差別后發(fā)現(xiàn)，各型的轉(zhuǎn)染效率存在差別，以AAV2最高，AAV4最低，其它三型介于這倆型之間。rAAV病毒的包裝，主要涉及包裝容量、包裝體系和病毒純化幾個(gè)方面。包裝容量小是rAAV載體最大的缺陷，僅為5kb左右，很多情況下不能滿(mǎn)足基因治療的需要，如何增加rAAV載體的包裝容量成為擴(kuò)大其應(yīng)用的熱點(diǎn)課題［10］。本組采用的pAAVIRES－h(huán)rGFP質(zhì)粒，僅保留了AAV包裝和整合不可缺少的ITRs，不僅增加了包裝容量，在兩個(gè)ITRs之間還有一核糖體基因IRES，可以實(shí)現(xiàn)雙基因共表達(dá)，又能促使AAV的核內(nèi)定位。

rAAV傳統(tǒng)的包裝體系不僅步驟繁瑣，而且存在AV的污染難以完全去除。本組采用的AAV Helper－Free System，就是對(duì)其不斷改造的基礎(chǔ)上建立的比較完善的包裝體系［11］。其中的pAAV－RC表達(dá)AAVCap和Rep蛋白；pHelper含有與AAV包裝有關(guān)的腺病毒基因E4、E2a和VA RNA；E1a和E1b則由293包裝細(xì)胞提供；該系統(tǒng)不僅簡(jiǎn)化了操作、提高了產(chǎn)量，而且避免了野生型AAV和AV的污染。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用該系統(tǒng)包裝6h時(shí)，各組都出現(xiàn)熒光表達(dá)，說(shuō)明該系統(tǒng)病毒“拯救”很快，而且細(xì)胞形態(tài)正常、生長(zhǎng)狀態(tài)良好。

病毒純化的目的是去除可能的AV和野生型AAV污染，及可復(fù)制性AAV（rcAAV）雜質(zhì)（含有非目的基因DNA序列的類(lèi)AAV顆粒）［12］。傳統(tǒng)的方法是硫酸銨濃縮、氯化銫密度梯度離心，操作繁瑣，病毒液損失太多［13］。近年來(lái)，吳小兵等［14］提出的氯仿處理－PEG／NaCl沉淀－氯仿反復(fù)抽提的方法，對(duì)rAAV病毒原液進(jìn)行濃縮和純化，效果較為滿(mǎn)意。

病毒感染效率和滴度的測(cè)定，許多研究者［15］應(yīng)用AAV易感細(xì)胞（HT1080）表達(dá)熒光的細(xì)胞數(shù)（或百分比）來(lái)進(jìn)行估算，簡(jiǎn)便易行，但是計(jì)數(shù)結(jié)果容易受培養(yǎng)基底色和熒光折射的影響，估算結(jié)果有較大偏差。本組采用原位β－半乳糖苷酶染色，計(jì)數(shù)藍(lán)染細(xì)胞個(gè)數(shù)，細(xì)胞間干擾小，而且能觀察病毒顆粒對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響情況。

本組應(yīng)用磷酸鈣三質(zhì)粒共沉淀法，成功制備了rAAV－h(huán)BMP7，通過(guò)對(duì)照組AAV－GFP表達(dá)熒光的細(xì)胞數(shù)量，測(cè)定包裝效率為94．16±0．13%。原位β－半乳糖苷酶染色估算rAAVhBMP7病毒原液的感染滴度為2．34×1011v．g／ml?？捎糜诤罄^實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

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