繡球菌多糖的提取與抗氧化活性研究

摘 要：采用微堿法提取繡球菌多糖，通過單因素分析和L9（34）正交試驗(yàn)探究提取溫度、提取時(shí)間、pH值、料液比4個(gè)因素對(duì)多糖提取率的影響；同時(shí)利用體外鄰苯三酚自氧化法和smirnoff法對(duì)多糖進(jìn)行抗氧化活性的測(cè)定。微堿法提取繡球菌多糖的最佳提取工藝條件為提取溫度60 ℃、提取時(shí)間2 h、提取液pH值9、料液比為1∶30。此條件下的多糖提取率為1.7%。多糖在0.06 mg·mL-1時(shí)對(duì)羥自由基清除率達(dá)到最大，為10.5%；在0.08 mg·mL-1時(shí)對(duì)超氧陰離子自由基清除率達(dá)到最大，為21.5%。繡球菌有望成為天然的抗氧化藥用真菌。

關(guān)鍵詞：繡球菌；多糖；微堿法；抗氧化

中圖分類號(hào)：Q629.12 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.04.003

Extraction and Antioxidant Activity of a Polysaccharide from Sparassis crispa

YU Guo-long，YE Lin，YUAN Shi-ting，ZHANG Li-xia

（College of Life Sciences，Daqing Normal College， Daqing，Heilongjiang 163712，China）

Abstract： With meningococcal polysaccharide extraction by alkali method， through the single factor analysis and L9（34） orthogonal experiment of extraction temperature， extraction time， pH value， solid to liquid ratio of four factors on the extraction rate of polysaccharide；while using in vitro adjacent benzene three phenol from determination of oxidation method and Smirnoff method were antioxidant activity of polysaccharides. The alkali extraction optimum extraction conditions of Sparassis crispa for polysaccharides extraction temperature 60 ℃， extraction time 2 h， extraction pH value 9， the ratio of solid to liquid 1∶30， polysaccharide under this condition the extraction rate of 1.7%. Polysaccharide in 0.06 mg·mL-1 on the hydroxyl radical scavenging rate reached the maximum at 0.08 mg·mL-1 10.5%， on superoxide anion free radical scavenging rate reached a maximum of 21.5%. Sparassis crispa was expected to become the natural antioxidant medicinal fungi.

Key words： Sparasis crispa.； polysaccharide； micro alkali； antioxidant

繡球菌（Sparassis crispa Fr.） 又名繡球蘑，屬無隔擔(dān)子菌亞綱、無褶菌目、繡球菌科、繡球菌屬 [1] ，是一種非常珍稀名貴的藥食兩用菌。多糖是繡球菌的主要活性成分，尤其是葡聚

糖的含量可達(dá)40%～50%，具有抗氧化、防癌抗癌、延年益壽和增強(qiáng)免疫的功能[2-3]。目前，對(duì)繡球菌多糖的研究主要集中在培養(yǎng)栽培和水溶多糖上，通過微堿法提取多糖并對(duì)其抗氧化活性的深入系統(tǒng)研究卻鮮見報(bào)道。筆者采用微堿法對(duì)繡球菌多糖進(jìn)行提取工藝條件優(yōu)化及抗氧化活性研究，旨在為繡球菌資源的開發(fā)利用提供可靠的試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

繡球菌子實(shí)體購自浙江磐安山村儂農(nóng)特產(chǎn)有限公司。

1.2 主要試劑

95%乙醇、無水乙醇、乙醚、NaOH、葡萄糖、氯仿、正丁醇、硫酸亞鐵、水楊酸、雙氧水、tris-HCL、濃硫酸、苯酚、鄰苯三酚、鹽酸、乙二胺四乙酸、考馬斯亮藍(lán)G250、牛血清蛋白（sigma）、葡聚糖（sigma）。所有試劑均為市售分析純。

1.3 試驗(yàn)儀器

BS 124S電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），NR-C26WF1冰箱（松下公司），通風(fēng)櫥（北京森雷博瑞實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司），HHS型電熱恒溫水浴鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），PDZ5-WS低速多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司），752N紫外可見分光光度計(jì)（上?？茖W(xué)精密儀器廠），真空干燥器，PHS-25型 數(shù)顯酸度計(jì)（上海天達(dá)儀器有限公司），DHG-9245A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 多糖的提取流程 繡球菌子實(shí)體烘干→粉碎→堿液浸泡過夜→提?。?次）→合并濾液→濃縮→脫蛋白（Sevage法）→離心（3 000 r·min-1，

10 min） →透析→醇沉（3倍體積95%乙醇）→洗滌（乙醇、乙醚）→干燥→粗多糖。

1.4.2 Sevage法脫游離蛋白[4-6] 將粗多糖配制成5%的飽和溶液與 Sevage試劑（氯仿∶正丁醇=4∶1（v/v））以4∶1的比例混強(qiáng)力振蕩后離心，去除變性的蛋白質(zhì)，介于提取液與 Sevage試劑交界處，反復(fù)做至無游離蛋白為止。

1.4.3 多糖中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定-考馬斯亮蘭法[7-9] 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行樣品測(cè)定。用測(cè)得的吸光值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相當(dāng)于牛血清白蛋白的微克數(shù)，計(jì)算出待測(cè)蛋白質(zhì)的含量。 樣品中蛋白質(zhì)含量=（所測(cè)得的蛋白質(zhì)濃度×稀釋倍數(shù)）/樣品質(zhì)量×100%。

1.4.4 多糖含量測(cè)定-酚硫酸法[5] 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程和線性范圍。利用回歸方程計(jì)算出樣品中得多糖含量，計(jì)算樣品中多糖的提取率。多糖提取率=多糖濃度×多糖質(zhì)量/原料重量×100%。

1.4.5 多糖提取工藝條件優(yōu)化 多糖提取工藝條件優(yōu)化采用單因素分析、正交試驗(yàn)、驗(yàn)證性試驗(yàn)進(jìn)行。單因素分析試驗(yàn)選取提取時(shí)間（1.0，1.5，2.0，2.5，3 h；pH值=8；60 ℃；重復(fù)3次）、提取溫度（40，50，60，70，80 ℃；pH值=8；2.0 h；重復(fù)3次）、pH值（pH值為7.5，8，8.5，9，9.5；70 ℃；2.0 h；重復(fù)3次）、料液比（1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶40；60 ℃；pH值=9；重復(fù)3次）4個(gè)因素，探究其對(duì)繡球菌多糖提取率的影響。在單因素分析的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)多糖提取率影響顯著的因素：提取溫度（40，50，60 ℃）、pH值（pH值為7，8，9）、提取時(shí)間（2.0，2.5，3 h）、料液比（1∶20，1∶25，1∶30）4因素3水平作為研究對(duì)象，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)（表1），探究對(duì)多糖提取率的影響。采用正交試驗(yàn)所確定的提取條件進(jìn)行繡球菌多糖的提取，并計(jì)算多糖提取率并進(jìn)行比較。

1.4.6 繡球菌多糖抗氧化活性的研究 繡球菌多糖抗氧化活性的研究分別采用羥基自由基清除試驗(yàn)—Smirnoff法[10]、超氧陰離子自由基清除試驗(yàn)—鄰苯三酚自氧化法[10]。清除率：（A0-A）/A0×100% ，式中：A0-對(duì)照液的吸光值，A-加入多糖溶液的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)含量

根據(jù)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)得蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)方程為y=5.6×10-2x-1.31×10-2 （r=0.997 8）。

標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。經(jīng)過測(cè)定繡球菌多糖中蛋白質(zhì)含量為10.2%。

2.2 多糖含量

根據(jù)酚硫酸法測(cè)定的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)方程為：y=9.4 ×10-3x-1.9×10-2 （r=0.997 5）。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。經(jīng)過測(cè)定繡球菌多糖含量為43.8%。

2.3 單因素分析試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 提取溫度對(duì)繡球菌多糖提取率的影響 測(cè)得的多糖提取結(jié)果如圖3所示。多糖在50～60 ℃提取率高，而后隨著溫度的升高而逐漸下降；一定范圍內(nèi)的溫度升高有利于多糖的提取，當(dāng)溫度過高超出一定范圍時(shí)，多糖中結(jié)合蛋白變性沉淀可能導(dǎo)致多糖提取率下降。

2.3.2 pH值對(duì)多糖提取率的影響 測(cè)得的多糖提取結(jié)果如圖4所示。隨著pH值的增大，多糖的提取率增加；但當(dāng)超過最適值8時(shí)，多糖的提取率下降，這可能是由于堿性過大導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)和部分蛋白質(zhì)變性沉淀，造成提取率下降。

2.3.3 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響 測(cè)得的多糖提取結(jié)果如圖5所示。隨著提取時(shí)間的增加，多糖的提取率明顯增加，而后逐漸趨于平緩，當(dāng)時(shí)間達(dá)到2.5 h后，多糖幾乎達(dá)到最大限度的溶出率，提取率不再增加。

2.3.4 料液比對(duì)多糖提取率的影響 測(cè)得的多糖提取結(jié)果如圖6所示。隨著料液比的增加，多糖的提取率不斷增大，在料液比較低時(shí)，提取液的濃度較大，多糖的溶出率較低，不利于提取。當(dāng)料液比增加到1∶20時(shí)，溶液濃度適中，多糖的溶出率較高，以后提取率逐漸趨于平穩(wěn)。

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果

通過L9（34）正交試驗(yàn)，獲得最佳優(yōu)化條件，結(jié)果見表2、表3。

從表2可以看出，極差越大對(duì)多糖的提取率影響越大，由大到小的順序依次為D>C>A>B，即提取溫度>pH值>提取時(shí)間>料液比。從表3可知，4個(gè)因素對(duì)提取率的影響都沒有達(dá)到顯著水平，因此，繡球菌多糖的最佳提取條件為A1B3C3D3，提取溫度60 ℃、提取時(shí)間2 h、pH值9、料液比1∶30。

2.5 驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果

通過驗(yàn)證性試驗(yàn)，在提取溫度60 ℃、提取時(shí)間2 h、pH值為9、料液比1∶30的條件下，繡球菌多糖的提取率為1.74%。高于其它正交提取條件，說明正交試驗(yàn)結(jié)果有效。

2.6 多糖抗氧化活性的研究結(jié)果

2.6.1 多糖對(duì)羥基自由基清除率的影響 根據(jù)羥基自由基清除試驗(yàn)，多糖對(duì)羥基自由基的清除率結(jié)果見圖7。多糖對(duì)羥自由基的清除作用隨多糖濃度增大而增大，但當(dāng)多糖濃度繼續(xù)增大，其對(duì)羥自由基的清除效果趨于平緩，達(dá)到最大值。測(cè)得多糖在0.06 mg·mL-1時(shí)抗氧化能力達(dá)到最大，清除率為10.53%。

2.6.2 多糖對(duì)超氧陰離子自由基清除率的影響 根據(jù)超氧陰離子自由基清除試驗(yàn)，多糖對(duì)羥基自由基的清除率結(jié)果見圖8。隨著多糖濃度的升高，對(duì)·OH自由基的清除作用也逐漸加強(qiáng)，且呈現(xiàn)量效關(guān)系，之后緩慢下降。繡球菌多糖在0.08 mg·mL-1抗氧化能力達(dá)到最大，清除率為21.5%。

3 結(jié)論與討論

微堿法提取繡球菌多糖的最佳提取工藝為提取溫度60 ℃、提取時(shí)間2 h、pH值9、料液比1∶30，此條件下提取率為1.7%。多糖在0.06 mg·mL-1時(shí)對(duì)羥自由基清除率達(dá)到最大為10.5%，在0.08 mg·mL-1時(shí)對(duì)超氧陰離子自由基清除率達(dá)到最大為21.5%；多糖中蛋白的含量為10.2%，糖含量為43.8%。因此，繡球菌可以作為一種新的具有抗氧化能力的藥用真菌。

本試驗(yàn)中提取的多糖為堿溶性多糖，堿液的濃度會(huì)對(duì)多糖的理化性質(zhì)造成影響，若要更加全面地了解繡球菌多糖的抗氧化活性，還應(yīng)采用其他提取方法進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，同時(shí)對(duì)提取方法還應(yīng)進(jìn)一步完善和改進(jìn)，以增加提取效率，為繡球菌資源的有效開發(fā)利用提供可靠依據(jù)。

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