電針對(duì)糖尿病大鼠胰腺組織CHOP、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)及胰腺超微結(jié)構(gòu)的影響

邵　俊，查必祥，袁愛紅，楊　駿，張金靜，薛秋菊，翟靜靜

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥　230031；

2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生部，安徽 合肥　230038)

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電針對(duì)糖尿病大鼠胰腺組織CHOP、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)及胰腺超微結(jié)構(gòu)的影響

邵俊1，查必祥1，袁愛紅1，楊駿1，張金靜1，薛秋菊2，翟靜靜2

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥230031；

2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生部，安徽 合肥230038)

[摘要]目的觀察針刺對(duì)糖尿病大鼠胰腺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及細(xì)胞凋亡的影響。方法高脂高糖飼料喂養(yǎng)加低劑量鏈脲佐菌素腹腔注射復(fù)制糖尿病大鼠模型，按血糖分層將模型復(fù)制成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、針刺組和二甲雙胍組，另設(shè)空白組。干預(yù)4周后檢測(cè)隨機(jī)血糖、大鼠胰腺組織CHOP、Bcl-2、Bax蛋白含量，觀察胰腺細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果模型復(fù)制后，模型復(fù)制組隨機(jī)血糖顯著高于空白組(P<0.05)。針刺組和二甲雙胍組隨機(jī)血糖均較治療前明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，針刺組隨機(jī)血糖水平呈降低趨勢(shì)(P>0.05)。模型組CHOP、Bax蛋白含量明顯高于空白組(P<0.05)，Bcl-2蛋白含量顯著低于空白組(P<0.05)；模型組、針刺組和二甲雙胍組CHOP、Bax蛋白含量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；針刺組和二甲雙胍組Bcl-2蛋白含量均顯著高于模型組(P<0.05)。針刺組和二甲雙胍組胰腺細(xì)胞線粒體排列整齊，在空泡變性，線粒體嵴斷裂，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)變形，糖原顆粒減少方面，其異常變化較模型組明顯減輕。結(jié)論針刺可通過改善糖尿病大鼠胰腺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，良性調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax蛋白含量，從而保護(hù)胰腺細(xì)胞。

[關(guān)鍵詞]糖尿??；鏈脲佐菌素；針刺；CHOP；Bax；Bcl-2

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是指由多種因素如高糖高脂、低氧、化學(xué)毒物等使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)Ca2+耗竭、蛋白質(zhì)糖基化抑制、二硫鍵錯(cuò)配以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)向高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)減少，導(dǎo)致未折疊蛋白和(或)錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)蓄積以及打破Ca2+的平衡狀態(tài)，從而使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能發(fā)生改變。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在2型糖尿病的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用[1]，其啟動(dòng)的凋亡途徑是近幾年來新發(fā)現(xiàn)的一種凋亡途徑。CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein-homologous protein，CHOP)是該凋亡途徑相關(guān)的凋亡信號(hào)分子中最重要的成員之一。針刺是否可以通過對(duì)CHOP蛋白的調(diào)節(jié)而改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而抑制胰腺細(xì)胞凋亡？本研究將對(duì)此進(jìn)行探討。

1材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)健康雄性SD大鼠80只，購(gòu)于安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，體質(zhì)量(220±20)g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(皖)2011-002。飼養(yǎng)在安徽中醫(yī)藥大學(xué)新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物飼養(yǎng)房，室溫為(27±3)℃，相對(duì)濕度為(55±5)%，保持通風(fēng)，自由飲水和攝食。

1.2主要儀器和試劑血糖儀及試紙：美國(guó)強(qiáng)生公司；LX 300型微量離心機(jī)：江蘇省海門市其林貝爾儀器制造有限公司；EPS 300型電泳儀：Tanon公司；H-7500型透射電鏡：Hitachi日立公司；G6805Ⅱ型電針儀：江蘇省蘇州醫(yī)療器械有限公司；華佗牌針灸美容針：蘇州天協(xié)針灸器械有限公司。鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)：美國(guó)Sigma公司；戊二醛：北京化學(xué)試劑公司；ECL超敏發(fā)光試劑盒：美國(guó)Thermo公司；RIPA細(xì)胞裂解液(強(qiáng))：碧云天生物技術(shù)研究所。

2方法

2.1動(dòng)物分組電腦隨機(jī)數(shù)字法選取10只大鼠作為空白組，全價(jià)鼠飼料喂養(yǎng)；剩余70只大鼠高糖高脂飼料(飼料配制于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)喂養(yǎng)4周后，連續(xù)2 d腹腔注射小劑量STZ 30 mg/kg，注射前均禁食12 h，注射后繼續(xù)高糖高脂飼料喂養(yǎng)1周后，尾靜脈采血測(cè)隨機(jī)血糖，血糖大于16.7 mmol/L提示模型復(fù)制成功，即STZ糖尿病大鼠，共30只(稱為“模型復(fù)制組”以區(qū)別后文“模型組”)，將其按血糖分層隨機(jī)分為模型組、針刺組和二甲雙胍組，每組10只。

2.2干預(yù)方法①針刺組：將大鼠以自制固定器固定，75%乙醇棉球無菌操作穴位，采用一次性無菌針灸針(規(guī)格：0.18 mm×13 mm)針刺，刺入2～4 mm深，小幅度持續(xù)勻速捻轉(zhuǎn)1 min，后三里和內(nèi)庭穴接通G6805 Ⅱ型電針儀(連續(xù)波，1 mA，10 Hz)。每次取一側(cè)肢體，兩側(cè)肢體輪流選取，每次治療15 min，每日針刺1次，7次為1個(gè)療程，共4個(gè)療程。二甲雙胍組：根據(jù)“人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比率表”確定大鼠的灌胃藥量，二甲雙胍100 mg/kg，研磨成粉末，與蒸餾水(加溫)混合成20 mg/mL的溶液，按大鼠體質(zhì)量所需要的藥物量進(jìn)行灌胃給藥。每日灌胃1次，療程與針刺組平行。②模型組和空白組：與針刺組同樣固定，但不作任何處理，療程與針刺組平行。干預(yù)期間各組大鼠均自由攝食、飲水，4組均為SPF級(jí)全價(jià)鼠飼料。

2.3觀察指標(biāo)及方法干預(yù)4周后，用美國(guó)強(qiáng)生型血糖儀測(cè)隨機(jī)血糖，用10%水合氯醛腹腔麻醉后置冰碟上，快速取出胰體、胰尾，用0.9%生理鹽水沖洗，紗布吸干后放入EP管中，置液氮中保存。另每組取1只大鼠的胰體、胰尾置2.0%戊二醛中固定。

2.3.1胰腺組織CHOP、Bcl-2、Bax蛋白含量檢測(cè)稱取胰腺組織進(jìn)行細(xì)胞裂解、勻漿、離心，取其上清液，向上清液中加入等量的2倍SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，加熱變性后冷卻，通過電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后進(jìn)行一抗孵育(兔抗，1∶800稀釋)和二抗孵育(1∶10 000稀釋)，最后采用ECL化學(xué)發(fā)光，置定影液中進(jìn)行定影。

2.3.2胰腺細(xì)胞的電鏡觀察取出胰腺組織，浸泡固定2 h(4 ℃，pH=7.2)，修切成1 mm×1 mm×3 mm大小的組織塊后，用0.07 mol/L PBS、0.19 mol/L蔗糖緩沖液充分清洗，再用1.0%鋨酸、0.24 mol/L PBS后固定2 h，漂洗、梯度乙醇脫水，浸泡過夜，次日從37 ℃(12 h)、45 ℃(12 h)到60 ℃(12 h)依次進(jìn)行加溫聚合，再行超薄切片，最后經(jīng)醋酸鈾和枸櫞酸鉛電子染色，用Hitachi-7500型透射電鏡觀察和攝像。

3結(jié)果

3.1一般情況STZ注射后1周，模型復(fù)制組大鼠飲水量、進(jìn)食量及尿量較前明顯增多。實(shí)驗(yàn)過程中，空白組大鼠精神狀態(tài)良好，反應(yīng)靈敏，毛發(fā)平伏亮澤，體質(zhì)量逐漸增加；模型組大鼠精神萎靡，毛發(fā)枯黃，多數(shù)出現(xiàn)尾部及指甲潰爛、大便干結(jié)等表征，體質(zhì)量均明顯減輕，死亡2例；針刺組、二甲雙胍組大鼠的精神狀況較空白組稍差，但明顯好于模型組，飲水量、飲食量及尿量較模型組有所減少，體質(zhì)量較治療前沒有明顯減輕，毛發(fā)光亮，未見尾部及指甲潰爛。

3.2隨機(jī)血糖變化模型復(fù)制前，模型復(fù)制組與空白組隨機(jī)血糖比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；模型復(fù)制后，模型復(fù)制組隨機(jī)血糖顯著高于空白組(P<0.05)。見表1。治療前，模型組、針刺組和二甲雙胍組隨機(jī)血糖水平顯著高于空白組(P<0.05)；治療后，模型組和空白組較干預(yù)前隨機(jī)血糖均有所升高，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，針刺組和二甲雙胍組隨機(jī)血糖均較治療前明顯降低(P<0.05)；二甲雙胍組隨機(jī)血糖降低值顯著大于模型組(P<0.05)。見表2。

表1　模型復(fù)制前后兩組大鼠隨機(jī)血糖比較±s)

注：與空白組比較，*P<0.05；

與同組模型復(fù)制前比較，#P<0.05。

表2　實(shí)驗(yàn)干預(yù)前后各組大鼠隨機(jī)血糖比較±s)

注：與空白組比較，*P<0.05；與同組治療前相比，#P<0.05；與模型組差值比較，△P<0.05。

3.3各組大鼠胰腺組織CHOP、Bax、Bcl-2蛋白含量比較模型組CHOP、Bcl-2蛋白含量明顯高于空白組(P<0.05)，Bax蛋白含量顯著低于空白組(P<0.05)；模型組、針刺組和二甲雙胍組CHOP、Bax蛋白含量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；針刺組和二甲雙胍組Bcl-2蛋白含量均顯著低于模型組(P<0.05)。見表3、圖1。

表3　各組大鼠胰腺組織CHOP、Bax、Bcl-2表達(dá)水平比較

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。

注：1.空白組；2.模型組；3.針刺組；4.二甲雙胍組。

3.4電鏡下各組大鼠胰腺細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察空白組大鼠胰腺細(xì)胞可見豐富而排列整齊的線粒體，線粒體嵴密集清晰，呈同心圓排列；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，清晰呈條索狀；細(xì)胞漿周圍有多量聚集成堆的酶原顆粒，凸向細(xì)胞漿。提示空白組胰腺細(xì)胞形態(tài)未受到明顯破壞。模型組可見少量散在分布的線粒體，出現(xiàn)不同程度的空泡變性、嵴距離明顯擴(kuò)張及斷裂；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、斷裂，核染色質(zhì)有邊集濃染現(xiàn)象；酶原顆粒明顯減少。提示模型組胰腺細(xì)胞受到明顯的破壞。針刺組線粒體排列較整齊，少數(shù)出現(xiàn)不同程度的空泡變性、腫脹、嵴擴(kuò)張，未見嵴斷裂；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)略有擴(kuò)張、變形，少數(shù)出現(xiàn)斷裂，排列較規(guī)律；酶原顆粒豐富，散在分布在細(xì)胞漿周圍。提示針刺組大鼠胰腺細(xì)胞形態(tài)異常明顯輕于模型組，但仍未恢復(fù)到空白組水平。二甲雙胍組線粒體數(shù)目正常，部分出現(xiàn)空泡變性、嵴輕度擴(kuò)張，未見嵴斷裂，細(xì)胞核邊集；少量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、斷裂，排列紊亂；酶原顆粒略減少，散在分布在細(xì)胞漿周圍。提示二甲雙胍組大鼠胰腺細(xì)胞形態(tài)異常明顯輕于模型組，但仍未恢復(fù)到空白組水平。見圖2。

4討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激啟動(dòng)的凋亡是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種凋亡途徑，與該途徑相關(guān)的重要凋亡信號(hào)分子有很多，CHOP是其中最重要的成員之一。CHOP/生長(zhǎng)抑制和DNA損傷誘導(dǎo)基因153是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異的轉(zhuǎn)錄因子[2]，是一個(gè)由抗凋亡向促凋亡轉(zhuǎn)換的重要信號(hào)分子。研究顯示，生理狀態(tài)下CHOP表達(dá)水平十分低下，出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)CHOP被大量激活，CHOP的持續(xù)升高通過影響細(xì)胞內(nèi)鈣的代謝和改變Bcl家族成員來啟動(dòng)細(xì)胞凋亡[3-6]。CHOP可上調(diào)促凋亡基因bax/bak，同時(shí)下調(diào)抗凋亡基因bcl-2。過表達(dá)的CHOP會(huì)導(dǎo)致胞質(zhì)內(nèi)Bax/Bak向線粒體轉(zhuǎn)移，并引起定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Bax/Bak構(gòu)象發(fā)生改變，最終可破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的完整性，導(dǎo)致Ca2+向胞質(zhì)外流。Bcl-2蛋白表達(dá)的減少可增加線粒體對(duì)促凋亡因子的敏感性[5]，最終啟動(dòng)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)[6]。

針灸治療2型糖尿病療效顯著，可控制和改善并發(fā)癥。既往研究顯示，針刺具有調(diào)控脂肪細(xì)胞因子[7]、干預(yù)胰島素信號(hào)[8]以及保護(hù)胰島β細(xì)胞形態(tài)和功能[9]等作用，從而治療2型糖尿病。本研究顯示，糖尿病大鼠胰腺組織CHOP蛋白表達(dá)較空白組明顯升高，針刺治療可以顯著降低CHOP蛋白表達(dá)，與二甲雙胍水平相當(dāng)。說明糖尿病大鼠胰腺組織存在著CHOP介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，而針刺治療可有效干預(yù)CHOP的蛋白表達(dá)，從而改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，這可能是針刺治療2型糖尿病的作用機(jī)制之一。糖尿病大鼠胰腺細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)較空白組顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，針刺治療可有效下調(diào)Bax蛋白表達(dá)，上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)(P<0.05)，說明針刺治療可顯著抑制糖尿病大鼠胰腺細(xì)胞凋亡。電鏡結(jié)果顯示，模型組胰腺細(xì)胞明顯受損，針刺組和二甲雙胍組胰腺細(xì)胞形態(tài)較模型組有明顯好轉(zhuǎn)，但仍不及空白組，提示針刺治療可有效保護(hù)糖尿病大鼠胰腺組織的細(xì)胞形態(tài)。同時(shí)，針刺組CHOP蛋白表達(dá)與模型組相比有下降趨勢(shì)卻無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與二甲雙胍在同一水平，這可能與針刺治療的調(diào)節(jié)有限性或治療的療程長(zhǎng)短有關(guān)，需進(jìn)一步研究。針刺對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠有著明顯的降糖作用，這與筆者既往研究[10]相似。但從其降糖效應(yīng)與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)其降糖效應(yīng)又與二甲雙胍組同當(dāng)，這可能與樣本量不足或療程較短有關(guān)，有待下一步研究。

糖尿病屬中醫(yī)學(xué)“消渴”范疇，本實(shí)驗(yàn)選用了后三里、內(nèi)庭和胰俞3個(gè)穴位治療，后三里為足陽(yáng)明胃經(jīng)合穴，且為胃的下合穴。早在《素問·陰陽(yáng)別論》就認(rèn)為“二陽(yáng)結(jié)謂之消”，又指出“二陽(yáng)者，陽(yáng)明也”。胃中熱盛，陰津枯竭，水谷即消。內(nèi)庭為足陽(yáng)明胃經(jīng)滎穴，《難經(jīng)·六十八難》有“滎主身熱”，而消渴病正是以陰虛為本，燥熱為標(biāo)。后三里配內(nèi)庭可清泄陽(yáng)明之熱。胰俞為治療消渴病的經(jīng)外奇穴，又名胃管下輸，首見于《備急千金要方》，其主治“消渴咽喉干、口干”，現(xiàn)仍為臨床治療糖尿病的特效穴位。三穴配伍經(jīng)本課題組前期研究[11]已經(jīng)證實(shí)對(duì)于糖尿病具有良好的療效。

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·針灸經(jīng)絡(luò)·

Effects of Electroacupuncture on Protein Expression of CHOP, Bax, and Bcl-2 in Pancreatic Tissue and Ultrastructure of Pancreas in Diabetic Rats

SHAOJun1,ZHABi-xiang2,YUANAi-hong1,YANGJun1,ZHANGJin-jing2,XUEQiu-ju2,ZHAIJing-jing2

(1.TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230031,China; 2.GraduateDivision,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the effects of acupuncture on endoplasmic reticulum stress and cell apoptosis in the pancreatic tissue of diabetic rats. MethodsA rat model of diabetes was induced by high-fat and high-sugar feeding and intraperitoneal injection of low-dose streptozotocin. The model rats were randomly divided into model group, acupuncture group, and metformin group according to blood glucose stratification; in addition, healthy rats were assigned to blank group. After 4 weeks of treatment, the levels of random blood glucose and proteins (Bax, Bcl-2, and CHOP) were determined, and the ultrastructure of pancreas was observed. ResultsAfter the model was established, the content of random blood glucose in the model group was significantly higher than that in the blank group (P<0.05). The acupuncture group and metformin group showed significant decreases in random blood glucose after treatment (P<0.05); compared with the model group, the acupuncture group showed a nonsignificant decrease in random blood glucose (P>0.05). Compared with the blank group, the model group had significantly higher levels of CHOP and Bax (P<0.05) but a significantly lower Bcl-2 level (P<0.05); there were no significant differences in the content of CHOP and Bax between the model group, acupuncture group, and metformin group (P>0.05); the content of Bcl-2 in the acupuncture group and metformin group was significantly lower than that in the model group (P<0.05). When compared with the model group, the acupuncture group and metformin group had significantly reduced abnormal changes with respect to vacuolar degeneration, rupture of mitochondrial cristae, rough endoplasmic reticulum deformation, and reduction in glycogen granules. ConclusionAcupuncture can improve the endoplasmic reticulum stress in the pancreas of diabetic rats and regulate the content of Bcl-2 and Bax, thus protecting pancreatic cells.

[Key words]diabetes; streptozotocin; acupuncture; CHOP; Bax; Bcl-2

收稿日期：(2015-05-10；編輯：曹健)

通信作者：袁愛紅，yuanah2004@aliyun.com

作者簡(jiǎn)介：邵俊(1980-)，男，主治醫(yī)師

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)青年基金項(xiàng)目(81202769)

[中圖分類號(hào)]R587.1[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2015.06.017