一次性離心運(yùn)動(dòng)及針刺對(duì)大鼠骨骼肌Wnt/βcatenin信號(hào)通路的影響

摘 要：目的：通過(guò)觀察離心運(yùn)動(dòng)及針刺干預(yù)對(duì)Wnt/βcatenin信號(hào)通路主要信號(hào)分子的影響，探討該通路在骨骼肌損傷修復(fù)中的作用。方法：將雄性SD大鼠隨機(jī)分為安靜組（C）、安靜針刺組（CA）、運(yùn)動(dòng)組（E）與運(yùn)動(dòng)針刺組（EA），E與EA組進(jìn)行坡度為-16°的一次性跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)；取大鼠股中間肌，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Wnt1、Wnt3a mRNA表達(dá)，免疫印跡法檢測(cè)βcatenin、GSK-3β蛋白磷酸化水平。結(jié)果：1）CA組Wnt1 mRNA表達(dá)均低于C組，且Wnt3a mRNA在12 h、72 h及120 h顯著高于C組（P<0.05）； CA組72 h GSK-3β活性與120 h βcatenin磷酸化水平顯著低于C組（P<0.05）。2）EA組Wnt1、Wnt3a mRNA表達(dá)的升高程度低于E組。72 h E組和EA組GSK-3β活性與βcatenin磷酸化水平均顯著低于C組（P<0.05），且E組βcatenin磷酸化水平顯著低于EA組（P<0.05）。 結(jié)論：一次性離心運(yùn)動(dòng)及運(yùn)動(dòng)后針刺能上調(diào)Wnt1、Wnt3a mRNA表達(dá)，降低GSK-3β活性與βcatenin磷酸化水平，針刺有上調(diào)βcatenin磷酸化水平的作用。

關(guān)鍵詞：離心運(yùn)動(dòng)；針刺；Wnt/βcatenin信號(hào)通路；衛(wèi)星細(xì)胞

中圖分類號(hào)：G804.23 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-3612（2012）10-0056-07

Effects of Eccentric Exercise and Acupuncture on the Wnt/βcatenin Signaling in Rat Skeletal Muscle

SHI Jipeng1， XU Hongqi1， ZHANG Xuelin2， GAO Xiaojuan3， ZHOU Yue4， LI Junping4， LUO Lina4， WANG Ruiyuan4

（1. Northeast Normal University， Changchun 130024， Jilin China；2. Shijiazhuang College， Shijiazhuang 050035， Hebei China； 3.Zhengzhou University， Zhengzhou 450001， Henan China； 4. Beijing Sport University， Beijing 100084， China）

Abstract：Objective：To observe the effects of eccentric exercise and acupuncture on Wnt/βcatenin signaling， then analyze its effects on skeletal muscle damage repairment. Methods：Male SD rats were divided into four groups：E and EA group were submitted to a single bout of eccentric exercise on a treadmill down a 16°decline. Vastus intermedius muscle was obtained in 12h， 24h， 48h， 72h， 120h postexercise and/or after needling. Wnt1 and Wnt3a mRNA expression were detected by RTPCR，phosphorylation of βcatenin and GSK3β were detected by western blot. Results：1） Wnt1 mRNA expression of CA group were lower than C group， Wnt3a mRNA expression of CA group were significantly higher than C group in 12h、72h and 120h （P<0.05）. GSK3β activity of CA group decreased significantly compared with C group in 72h （P<0.05）， phosphorylation of βcatenin also decreased significantly compared with C group in 120h （P<0.05）. 2） Wnt1 and Wnt3a mRNA expression of EA group were lower than E group. GSK3β activity and phosphorylation of βcatenin of E and EA group decreased significantly compared with C group in 72h （P<0.05）， and phosphorylation of βcatenin in E group decreased significantly than EA group （P<0.05）. Conclusion： A single bout of eccentric exercise and needling after exercise can upregulate the mRNA expression of Wnt1 and Wnt3a， decrease the activity of GSK3β and phosphorylation of βcatenin， needling has the effect on upregulating phosphorylation of βcatenin.

Key words：eccentric exercise； acupuncture； Wnt/βcatenin signaling；satellite cell

不習(xí)慣的運(yùn)動(dòng)，尤其是離心運(yùn)動(dòng)能導(dǎo)致肌膜、T管、肌原纖維和骨架系統(tǒng)等骨骼肌延遲性超微結(jié)構(gòu)的改變，功能變化表現(xiàn)為骨骼肌出現(xiàn)延遲性肌肉酸痛，收縮和伸展功能下降，嚴(yán)重影響肌肉的工作能力，且與骨骼肌損傷密切相關(guān)[1]。因此，在運(yùn)動(dòng)后采取有效的干預(yù)措施以促進(jìn)骨骼肌功能的快速恢復(fù)對(duì)運(yùn)動(dòng)損傷的治療有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。

骨骼肌在生長(zhǎng)發(fā)育、損傷和運(yùn)動(dòng)時(shí)均能激活Wnt/βcatenin信號(hào)通路[2]，并且在骨骼肌損傷修復(fù)過(guò)程中，衛(wèi)星細(xì)胞的增殖、分化及自我更新均與該信號(hào)通路密切相關(guān)。最新的研究進(jìn)展提示，骨骼肌損傷修復(fù)時(shí)，Notch和Wnt信號(hào)通路對(duì)衛(wèi)星細(xì)胞的增殖與分化進(jìn)行了精密的時(shí)續(xù)性控制，增殖與分化的轉(zhuǎn)換是兩信號(hào)通路相互競(jìng)爭(zhēng)抑制的結(jié)果，即Notch途徑在成肌細(xì)胞增殖過(guò)程中占主導(dǎo)地位，隨后轉(zhuǎn)換至Wnt途徑，成肌細(xì)胞分化并融合為肌管[3]。兩信號(hào)通路之間的關(guān)系雖在人工肌肉損傷模型中已得到驗(yàn)證，但在骨骼肌收縮性損傷（離心運(yùn)動(dòng)）及肌肉生長(zhǎng)（過(guò)度負(fù)荷性肌肉肥大、耐力訓(xùn)練）等生理刺激模型中仍有很多未知領(lǐng)域。

GSK-3β作為細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要成分，在Wnt/βcatenin信號(hào)通路中起著關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[4]。由GSK-3β介導(dǎo)的磷酸化作用可引起βcatenin的穩(wěn)定性降低；當(dāng)Wnt/βcatenin信號(hào)通路被激活時(shí)，GSK-3β的Ser9位點(diǎn)磷酸化可導(dǎo)致其活性降低，進(jìn)而減少對(duì)βcatenin的磷酸化，使βcatenin穩(wěn)定性增強(qiáng)，這種累積打破了細(xì)胞內(nèi)原有的βcatenin出核與入核的平衡，使得細(xì)胞核內(nèi)的βcatenin大大增加。細(xì)胞核內(nèi)的βcatenin與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄活性，啟動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞的增殖或活化[5]。因此，βcatenin是Wnt/βcatenin信號(hào)通路中最重要的信息分子[6]。本研究通過(guò)觀察一次性離心運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)間點(diǎn)骨骼肌內(nèi)Wnt配體、βcatenin及GSK-3β的變化特征，探討Wnt/βcatenin信號(hào)通路在骨骼肌損傷修復(fù)中的作用及針刺的功效。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)條件 雄性SpragueDawley（SD）大鼠，SPF/VAF級(jí)，8周齡，體重為（231±5.4）g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。許可證編號(hào)：SCXK（京）2006-0009。于屏障式實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房飼養(yǎng)、訓(xùn)練，每籠3～4只，環(huán)境溫度21℃～22℃，12 h光照/12 h黑暗交替，自由飲食。大鼠在屏障式動(dòng)物房安靜飼養(yǎng)一周以適應(yīng)環(huán)境。

1.2 動(dòng)物分組和運(yùn)動(dòng)方案 96只雄性SD大鼠隨機(jī)分成四組，安靜組（n=6）、安靜針刺組（n=30）、運(yùn)動(dòng)組（n=30）、運(yùn)動(dòng)針刺組（n=30）。大鼠適應(yīng)環(huán)境3 d，之后進(jìn)行90 min離心運(yùn)動(dòng)（16 m/min，-16°坡度）。安靜組與安靜針刺組不運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)組與運(yùn)動(dòng)針刺組離心運(yùn)動(dòng)，且兩組的運(yùn)動(dòng)負(fù)荷相同。運(yùn)動(dòng)組訓(xùn)練結(jié)束后無(wú)干預(yù)恢復(fù)措施；運(yùn)動(dòng)針刺組訓(xùn)練后，用直徑0.25 mm毫針斜刺兩側(cè)股四頭肌，留針2 min；安靜針刺組針刺干預(yù)措施同運(yùn)動(dòng)針刺組。于運(yùn)動(dòng)后或針刺后12 h、24 h、48 h、72 h、120 h取材。

1.3 標(biāo)本采集與處理 大鼠稱重后，用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血后，迅速分離大鼠股中間肌，用錫紙包好，投入液氮中保存。取材完成后將標(biāo)本轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，備用。

1.4 主要試劑及試劑盒 RNA提取試劑Trizol，購(gòu)自invitrogen；cDNA合成試劑盒，購(gòu)自TOYOBO；SYBR Premix Ex TagTM試劑盒，購(gòu)自TaKaRa；PhosphoβCatenin，購(gòu)自Bio world公司；βCatenin、GSK-3β、PhosphoGSK-3β，購(gòu)自Cell Signaling Technology公司。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)與方法

1.5.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)試方法 稱取50～100 mg股中間肌，參照Trizol試劑盒說(shuō)明書抽提RNA。取0.5 μL總RNA，以oligo dT為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。PCR按以下反應(yīng)體系進(jìn)行：2×SYBR Premix Ex TagTM 10 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O 8.5 μL，模板cDNA 0.5 μL，總體積20 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性（95℃，240 s），40個(gè)PCR循環(huán)，變性（94℃，20 s），退火（62℃，20 s），延伸（72℃，10 s）。以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀讀數(shù)分析，根據(jù)公式2ΔΔCt計(jì)算各樣品目的基因的相對(duì)表達(dá)量。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中提供的目的基因序列自行設(shè)計(jì)引物序列（表1），由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.5.2 Western blot方法測(cè)定GSK-3β、βcatenin蛋白磷酸化水平測(cè)定方法 取出肌肉組織加入液氮研磨后，稱取0.1 g組織，以1：9加入預(yù)冷的裂解液，電動(dòng)勻漿器（置于冰浴中）勻漿，冰上孵育20 min，4℃離心，12 000 rpm，20 min，取上清。采用BCA測(cè)試法定量蛋白濃度。Western Blotting測(cè)定GSK-3β、βcatenin蛋白磷酸化水平。濃縮膠濃度為4%，分離膠濃度為10%。樣品通過(guò)濃縮膠時(shí)電壓為90V，電泳1 h，溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后電壓改為150 V，電泳大約3.5 h。電泳結(jié)束后取出凝膠，采用濕轉(zhuǎn)方法，將電泳后的蛋白樣品轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜電流300 mA，時(shí)間100 min。把膜放入盛有3%TBST BSA的培養(yǎng)皿中，室溫振搖封閉1 h。棄去TBST BSA，用TBST振搖洗膜3次，每次10 min。用3%TBST BSA稀釋一抗PGSK-3β（1：1 000）、GSK-3β（1：4 000）、Pβcatenin（1∶1 000）、βcatenin（1∶2 000），把膜放入盛有抗體的塑料試管中，4℃振搖過(guò)夜。棄去一抗，TBST振搖洗膜3次，每次10 min。用3%TBST BSA稀釋二抗，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG（1：10 000），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG（1：8 000），室溫振搖結(jié)合二抗40 min。棄去二抗，TBST洗膜3次，每次10 min。PVDF置于ECL發(fā)光液中，室溫反應(yīng)5 min，之后將膜放入曝光盒中，膠片壓片、感光，顯影、定影、水沖洗后，室溫晾干，用凝膠影像分析系統(tǒng)拍攝照片。ImageJ處理?xiàng)l帶，ImageQuant TL軟件計(jì)算條帶Integrated Optical Density值。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法 測(cè)試指標(biāo)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（M±SE）表示；采用雙向分類方差分析（TwoWay Classification ANOVA）首先建立飽和模型（Full factorial）對(duì)處理因素（安靜、安靜針刺、運(yùn)動(dòng)、運(yùn)動(dòng)針刺），時(shí)間因素（12 h、24 h、48 h、72 h、120 h），以及兩者的交互作用進(jìn)行分析；如兩因素交互作用不顯著，則進(jìn)一步建立非飽和模型（Main Effects）以分析各因素的主效應(yīng)；如兩因素交互作用顯著，則采用SNKq檢驗(yàn)（NewmanKeuls Post Hoc Test）進(jìn)行不同組別間的多重比較，并參考Bonferroni法與Tukey法的多重比較結(jié)果；統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性水平定為P<0.05。

2 研究結(jié)果

由各測(cè)試指標(biāo)雙向分類方差分析的飽和模型可知，時(shí)間與處理兩因素，以及兩者的交互作用對(duì)Wnt1、Wnt3a mRNA表達(dá)及GSK-3β、βcatenin蛋白磷酸化水平的影響均非常顯著（P<0.01），需逐一分析各因素的單獨(dú)效應(yīng)。

2.1 一次性離心運(yùn)動(dòng)及針刺后各測(cè)試時(shí)間點(diǎn)Wnt1、Wnt3a mRNA表達(dá)的變化 安靜針刺組Wnt1的mRNA表達(dá)在12 h、24 h均顯著低于安靜組（P<0.05），48 h達(dá)到安靜水平，之后的兩時(shí)間點(diǎn)均趨于安靜水平。運(yùn)動(dòng)組Wnt1 mRNA表達(dá)呈先升高后降低的趨勢(shì)，12 h已升至較高水平，24 h達(dá)到峰值；運(yùn)動(dòng)針刺組Wnt1 mRNA表達(dá)趨勢(shì)同運(yùn)動(dòng)組，但峰值出現(xiàn)在48 h，并且升高幅度要小于運(yùn)動(dòng)組（表2、圖1）。

圖1 一次性離心運(yùn)動(dòng)及針刺后各測(cè)試時(shí)間點(diǎn)Wnt1 mRNA表達(dá)的變化

注：安靜組與安靜針刺組、運(yùn)動(dòng)組、運(yùn)動(dòng)針刺組相比，* P<0.05，** P<0.01；運(yùn)動(dòng)組與運(yùn)動(dòng)針刺組相比，# P<0.05，## P<0.01；12 h與24 h、48 h、72 h、120 h相比，↑P<0.05，↑↑ P<0.01。

安靜針刺組Wnt3a的mRNA表達(dá)在12 h、72 h及120 h均顯著高于安靜組，24 h、48 h有低于安靜組的趨勢(shì)。運(yùn)動(dòng)組、運(yùn)動(dòng)針刺組Wnt3a mRNA的表達(dá)也基本呈先升高后降低的趨勢(shì)，峰值均出現(xiàn)在48 h；并且，各時(shí)間點(diǎn)運(yùn)動(dòng)針刺組Wnt3a mRNA表達(dá)均顯著低于運(yùn)動(dòng)組（表3、圖2）。

2.2 一次性離心運(yùn)動(dòng)及針刺后各測(cè)試時(shí)間點(diǎn)GSK-3β、βcatenin蛋白磷酸化水平的變化 安靜針刺組GSK-3β磷酸化水平呈先降低后升高的趨勢(shì)，在12 h、24 h均低于安靜組，48 h恢復(fù)至安靜水平，72 h時(shí)達(dá)到峰值。運(yùn)動(dòng)組除運(yùn)動(dòng)后72 h骨骼肌GSK-3β的磷酸化程度顯著升高外，其他時(shí)間點(diǎn)GSK-3β的磷酸化程度都比較接近，但均高于安靜組；運(yùn)動(dòng)針刺組12 h GSK-3β的磷酸化程度顯著低于安靜組與運(yùn)動(dòng)組，之后呈逐漸升高趨勢(shì)，在72 h達(dá)到峰值，但此時(shí)仍低于運(yùn)動(dòng)組（表4、圖3）。

圖2 一次性離心運(yùn)動(dòng)及針刺后各測(cè)試時(shí)間點(diǎn)Wnt3a mRNA表達(dá)的變化

注：安靜組與安靜針刺組、運(yùn)動(dòng)組、運(yùn)動(dòng)針刺組相比，* P<0.05，** P<0.01；運(yùn)動(dòng)組與運(yùn)動(dòng)針刺組相比，# P<0.05，## P<0.01；12 h與24 h、48 h、72 h、120 h相比，↑P<0.05，↑↑ P<0.01。

安靜針刺組βcatenin磷酸化水平出現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，48 h降至安靜水平，在72 h（P>0.05）與120 h（P<0.05）均低于安靜水平。運(yùn)動(dòng)組與安靜組相比，βcatenin磷酸化水平在12 h顯著升高，之后至72 h基本呈降低趨勢(shì)，72 h降至最低，120 h再次升高；運(yùn)動(dòng)針刺組12 h、24 h及48 h與安靜組相比并無(wú)顯著差異，72 h及120 h顯著低于安靜組，且72 h運(yùn)動(dòng)針刺組βcatenin磷酸化水平顯著高于運(yùn)動(dòng)組（表5、圖4）。

圖3 一次性離心運(yùn)動(dòng)及針刺后各測(cè)試時(shí)間點(diǎn)GSK-3β蛋白磷酸化水平的變化

注：安靜組與安靜針刺組、運(yùn)動(dòng)組、運(yùn)動(dòng)針刺組相比，* P<0.05，** P<0.01；運(yùn)動(dòng)組與運(yùn)動(dòng)針刺組相比，# P<0.05，## P<0.01；12 h與24 h、48 h、72 h、120 h相比，↑ P<0.05，↑↑ P<0.01。

3 討 論

3.1 針刺對(duì)正常骨骼肌Wnt/βcatenin信號(hào)通路的影響 迄今，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)至少發(fā)現(xiàn)19個(gè)Wnt家族成員，并且所有的Wnt蛋白都具有共同的特征，如具有分泌功能的信號(hào)肽、多個(gè)功能性糖基化位點(diǎn)，以及保證行使正常折疊與分泌功能的多個(gè)半胱氨酸殘基，這些特點(diǎn)對(duì)其行使功能具有重要的意義[7]。Wnt蛋白是有效的形態(tài)發(fā)生因子，大量文獻(xiàn)闡述了Wnt蛋白對(duì)胚胎期肌生成的作用，從誘導(dǎo)肌性細(xì)胞生成到肌細(xì)胞增殖，Wnt蛋白的功能幾乎涵蓋了肌肉生成的各個(gè)方面[8]。

相比之下，有關(guān)Wnt蛋白在成體骨骼肌再生中的作用知之甚少。在成體骨骼肌，成肌細(xì)胞或/和肌纖維是Wnt蛋白的來(lái)源[9]。Wnt信號(hào)途徑通過(guò)自分泌或旁分泌來(lái)促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞的增殖、分化[7]。

研究認(rèn)為，Wnt1與Wnt3a蛋白可以發(fā)揮協(xié)同作用激活Wnt/βcatenin信號(hào)通路。Anthony Otto等人實(shí)驗(yàn)顯示，在成熟肌纖維的傷口愈合過(guò)程中過(guò)度表達(dá)Wnt1、Wnt3a蛋白可引起衛(wèi)星細(xì)胞的顯著增殖[6]。本研究通過(guò)檢測(cè)Wnt1 mRNA表達(dá)發(fā)現(xiàn)，安靜針刺組Wnt1的mRNA表達(dá)在12 h、24 h均顯著低于安靜組，48 h達(dá)到安靜水平，之后的兩時(shí)間點(diǎn)均趨于安靜水平；表明針刺有降低Wnt1 mRNA表達(dá)的作用。安靜針刺組Wnt3a的mRNA表達(dá)在12 h、72 h及120 h均顯著高于安靜組，24 h、48 h有低于安靜組的趨勢(shì)；提示針刺可能通過(guò)上調(diào)Wnt3a的mRNA表達(dá)來(lái)激活Wnt/βcatenin信號(hào)通路，而且Wnt1與Wnt3a之間發(fā)揮協(xié)調(diào)作用也可能與不同的刺激方式有關(guān)。針刺后，骨骼肌Wnt1 mRNA表達(dá)普遍低于安靜水平及Wnt3a的mRNA表達(dá)在120 h仍顯著高于安靜水平的現(xiàn)象提示，需要在12 h之前增加取材時(shí)間點(diǎn)及延長(zhǎng)取材時(shí)間以便更完整地觀察其變化特征。

目前，有關(guān)Wnt/βcatenin信號(hào)通路的研究多集中在不同器官的生長(zhǎng)、發(fā)育及疾病防治等方面[5]，尚未見到有關(guān)針刺骨骼肌對(duì)該信號(hào)通路影響的報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，安靜針刺組GSK-3β磷酸化水平呈先降低后升高的趨勢(shì)，在12 h、24 h均低于安靜組（P>0.05），48 h恢復(fù)至安靜水平，72 h時(shí)達(dá)到峰值（P<0.05）；表明12 h、24 h的GSK-3β活性比安靜水平時(shí)高，72 h時(shí)間點(diǎn)GSK-3β的活性為最低。安靜針刺組βcatenin磷酸化水平出現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，48 h降至安靜水平，在72 h（P>0.05）與120 h（P<0.05）均低于安靜水平；推測(cè)72～120 h βcatenin在細(xì)胞核內(nèi)會(huì)出現(xiàn)增多的現(xiàn)象，這與72 h GSK-3β的活性為最低的變化相一致，表明此時(shí)Wnt/βcatenin信號(hào)通路可能處于激活狀態(tài)。

Kamal Ameis等人針刺正常大鼠脛骨前肌的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，針刺可能通過(guò)激活衛(wèi)星細(xì)胞來(lái)修復(fù)因針刺而造成的肌肉微損傷，即針刺能刺激骨骼肌出現(xiàn)明顯的細(xì)胞及分子反應(yīng)進(jìn)而引發(fā)骨骼肌的生肌過(guò)程，因此推測(cè)針刺造成的骨骼肌微損傷可能是針刺治療作用的機(jī)制之一[10]。研究認(rèn)為，肌肉再生由一系列協(xié)調(diào)發(fā)生的事件組成，從衛(wèi)星細(xì)胞的激活到成肌細(xì)胞的增殖、分化及最終形成肌管，需要多個(gè)信號(hào)通路進(jìn)行對(duì)話。Notch和Wnt通路在肌肉的發(fā)育及出生后肌肉的生成過(guò)程中相互作用，兩者之間的交互對(duì)話似乎有助于成體骨骼肌修復(fù)過(guò)程中不同階段的轉(zhuǎn)換[11]。實(shí)驗(yàn)證明，Notch途徑在成肌細(xì)胞增殖過(guò)程中占主導(dǎo)地位；隨后轉(zhuǎn)換至Wnt途徑，成肌細(xì)胞分化并融合為肌管[3]。

由此可見，確定Notch和Wnt途徑的轉(zhuǎn)換位點(diǎn)有助于掌握出生后肌生成過(guò)程中Notch和Wnt途徑調(diào)控細(xì)胞定向的機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，GSK-3β與Notch途徑之間具有正相關(guān)性，而GSK-3β與Wnt途徑之間具有負(fù)相關(guān)性。肌肉損傷1 d后，Notch途徑被激活，GSK-3β活性亦增高；Wnt途徑同GSK-3活性正相反，此時(shí)處于弱化階段。然而，在肌肉修復(fù)的1～4 d，Wnt途徑活性增強(qiáng)，GSK-3β與Notch途徑活性降低[3]。由此認(rèn)為，GSK-3β可能是Notch和Wnt通路的重要結(jié)合點(diǎn)[12]。在TOPGAL小鼠的單核細(xì)胞內(nèi)抑制GSK-3β活性可導(dǎo)致βcatenin表達(dá)增加，Wnt受體活性增高。此外，應(yīng)用Notch抑制劑γsecretase處理成肌細(xì)胞可降低GSK-3β活性[3]。這些研究進(jìn)一步確認(rèn)，GSK-3β活性可能是Notch途徑和Wnt途徑之間相互轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

本研究中，安靜針刺組GSK-3β磷酸化程度在12 h、24 h均低于安靜組（P>0.05），說(shuō)明此時(shí)間點(diǎn)GSK-3β的活性要比安靜時(shí)高；這與前述肌肉損傷1 d后，Notch途徑被激活，GSK-3β活性亦增高的結(jié)論相一致，說(shuō)明在針刺之后的24 h內(nèi)Notch信號(hào)通路有可能處于激活狀態(tài)。由于本研究重點(diǎn)關(guān)注Wnt信號(hào)通路，沒有檢測(cè)與Notch通路相關(guān)的其他指標(biāo)，因此還無(wú)法進(jìn)一步確定兩者之間的關(guān)系。

目前，還未見到針刺對(duì)Wnt基因表達(dá)影響的相關(guān)研究，本實(shí)驗(yàn)試圖在這方面進(jìn)行嘗試性探索。針刺后72～120 h之間，Wnt3a基因表達(dá)顯著增高的現(xiàn)象與GSK-3β活性降低及βcatenin磷酸化水平降低相一致；推測(cè)，針刺可能通過(guò)Wnt3a的表達(dá)而對(duì)骨骼肌Wnt/βcatenin信號(hào)通路產(chǎn)生激活作用。

3.2 針刺對(duì)一次性離心運(yùn)動(dòng)后骨骼肌Wnt/βcatenin信號(hào)通路的影響 本研究中，大鼠以-16°的坡度進(jìn)行一次性離心運(yùn)動(dòng)后，運(yùn)動(dòng)組Wnt1 mRNA表達(dá)呈先升高后降低的趨勢(shì)，12 h已升至較高水平，24 h達(dá)到峰值；運(yùn)動(dòng)針刺組Wnt1 mRNA表達(dá)趨勢(shì)同運(yùn)動(dòng)組，但峰值出現(xiàn)在48 h，并且升高幅度要小于運(yùn)動(dòng)組。運(yùn)動(dòng)組、運(yùn)動(dòng)針刺組Wnt3a mRNA的表達(dá)也基本呈先升高后降低的趨勢(shì)，峰值均出現(xiàn)在48 h；并且，各時(shí)間點(diǎn)運(yùn)動(dòng)針刺組Wnt3a mRNA表達(dá)均顯著低于運(yùn)動(dòng)組。表明運(yùn)動(dòng)和/或運(yùn)動(dòng)性損傷能激活Wnt/βcatenin信號(hào)通路，而針刺對(duì)其激活程度有降低及延遲作用。

Anthony Otto等人實(shí)驗(yàn)表明，肌損傷會(huì)激活Wnt配體的轉(zhuǎn)錄，以及激活對(duì)Wnt信號(hào)通路敏感的細(xì)胞系[6]，并且Wnt信號(hào)通路可能與運(yùn)動(dòng)對(duì)肌肉損傷的程度有關(guān)[13]。張學(xué)林通過(guò)電鏡觀察骨骼肌超微結(jié)構(gòu)圖發(fā)現(xiàn)，急性運(yùn)動(dòng)組在運(yùn)動(dòng)后120 h，肌節(jié)結(jié)構(gòu)仍處于紊亂狀態(tài)，而急性運(yùn)動(dòng)針刺組沒有亂紋的結(jié)構(gòu)變化，肌節(jié)結(jié)構(gòu)已經(jīng)基本恢復(fù)；說(shuō)明針刺可以使骨骼肌超微結(jié)構(gòu)損傷快速恢復(fù)[14]。這與本研究中針刺對(duì)Wnt/βcatenin信號(hào)通路的激活程度有降低作用的結(jié)果相一致。說(shuō)明針刺對(duì)運(yùn)動(dòng)后損傷的肌肉有修復(fù)作用，能快速減輕其損傷程度，降低對(duì)Wnt信號(hào)通路的激活作用。

針刺正常骨骼肌對(duì)Wnt1的mRNA表達(dá)有降低作用，而運(yùn)動(dòng)及運(yùn)動(dòng)針刺卻均能使其顯著上調(diào)，進(jìn)一步說(shuō)明不同刺激方式對(duì)Wnt1 mRNA表達(dá)可能產(chǎn)生不同的影響。

本研究中，除運(yùn)動(dòng)后72 h時(shí)骨骼肌GSK-3β的磷酸化程度顯著升高外，其他時(shí)間點(diǎn)GSK-3β的磷酸化程度都比較接近，但均高于安靜組；提示運(yùn)動(dòng)可能對(duì)GSK-3β活性有降低作用，但在運(yùn)動(dòng)后72 h活性為最低。運(yùn)動(dòng)針刺組12 h時(shí)GSK-3β的磷酸化程度顯著低于安靜組與運(yùn)動(dòng)組，之后呈逐漸升高趨勢(shì)，在72 h達(dá)到峰值，但此時(shí)仍低于運(yùn)動(dòng)組；提示針刺具有提高GSK-3β活性的作用；48 h GSK-3β與βcatenin磷酸化水平均高于運(yùn)動(dòng)組的現(xiàn)象尚無(wú)法解釋，可能與運(yùn)動(dòng)及針刺的雙重刺激導(dǎo)致其他調(diào)節(jié)因子激活有關(guān)。

GSK-3是一種多功能的絲/蘇氨酸蛋白激酶，包括GSK-3α與β兩個(gè)亞基。GSK-3是細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要成分，不僅參與細(xì)胞內(nèi)糖代謝過(guò)程而且還參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化和細(xì)胞凋亡等多種重要生理過(guò)程[15]。應(yīng)用阻斷劑來(lái)抑制因收縮引起的AKt活性升高并不能完全阻斷GSK-3活性的降低[16]；表明運(yùn)動(dòng)后骨骼肌GSK-3活性的降低還有其他作用機(jī)制。而且，在某些情況下，肌肉收縮導(dǎo)致的GSK-3失活并不能反映其磷酸化糖原合成酶的變化狀況[17]。這些結(jié)果均說(shuō)明肌肉收縮導(dǎo)致GSK-3失活可能與糖原代謝無(wú)關(guān)，還有另外一條上游代謝通路。研究認(rèn)為，GSK-3的β亞基是調(diào)控多功能蛋白βcatenin的重要因子，是Wnt/βcatenin信號(hào)通路行使功能的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[4]。

本研究中，運(yùn)動(dòng)組GSK-3β活性的變化也說(shuō)明了運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌Wnt信號(hào)通路有調(diào)控作用，而針刺在總體上有減輕其活性降低的作用。運(yùn)動(dòng)可能對(duì)機(jī)體內(nèi)眾多的信號(hào)通路產(chǎn)生影響，因此只通過(guò)GSK-3β磷酸化水平來(lái)解釋運(yùn)動(dòng)對(duì)Notch與Wnt信號(hào)通路的影響還缺乏依據(jù)，需進(jìn)行深入研究。

運(yùn)動(dòng)組與安靜組相比，βcatenin磷酸化水平在12 h顯著升高，之后至72 h基本呈降低趨勢(shì)，72 h降至最低，120 h再次升高；運(yùn)動(dòng)針刺組12 h、24 h及48 h與安靜組相比并無(wú)顯著差異，72 h及120 h顯著低于安靜組；兩組數(shù)據(jù)均說(shuō)明72 h時(shí)Wnt/βcatenin信號(hào)通路活性最強(qiáng)。72 h運(yùn)動(dòng)針刺組βcatenin磷酸化水平顯著高于運(yùn)動(dòng)組，以及在120 h仍低于安靜水平，提示針刺可能降低了運(yùn)動(dòng)對(duì)Wnt/βcatenin信號(hào)通路的激活程度（與Wnt1、Wnt3a mRNA結(jié)果一致），但是能延長(zhǎng)通路保持較高活性的時(shí)間。運(yùn)動(dòng)組120 h βcatenin磷酸化水平再次升高的現(xiàn)象與Wnt3a的mRNA表達(dá)在120 h也出現(xiàn)升高的現(xiàn)象相一致，但是觀察其上游信號(hào)分子GSK-3β的磷酸化水平與運(yùn)動(dòng)組相比幾乎沒有差異，因此運(yùn)動(dòng)還可能激活了體內(nèi)的其他調(diào)控機(jī)制，需進(jìn)一步研究。

有關(guān)運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌Wnt信號(hào)途徑的研究很少。William G.研究發(fā)現(xiàn)，在體運(yùn)動(dòng)可激活骨骼肌的Wnt/βcatenin信號(hào)通路，說(shuō)明運(yùn)動(dòng)能誘導(dǎo)多種基因和成肌調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，且βcatenin的調(diào)節(jié)方式具有強(qiáng)度依賴性；在力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)βcatenin完全脫磷酸化，因此Wnt信號(hào)通路可能與肌肉損傷程度有關(guān)，根據(jù)刺激強(qiáng)度募集衛(wèi)星細(xì)胞，誘導(dǎo)肌生成[13]。綜合Wnt1、Wnt3a mRNA表達(dá)及GSK-3β、βcatenin的磷酸化水平等實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與運(yùn)動(dòng)組相比，運(yùn)動(dòng)后針刺對(duì)上述指標(biāo)均有降低作用，即針刺降低了運(yùn)動(dòng)對(duì)Wnt/βcatenin信號(hào)通路的激活作用，提示針刺能減輕運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌造成的損傷。

4 結(jié) 論

針刺正常骨骼肌，可能通過(guò)上調(diào)Wnt3a的表達(dá)來(lái)影響Wnt/βcatenin信號(hào)通路；Notch和Wnt兩信號(hào)通路在骨骼肌損傷修復(fù)過(guò)程中的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。一次性離心運(yùn)動(dòng)及運(yùn)動(dòng)后針刺能上調(diào)Wnt1、Wnt3a mRNA表達(dá)，降低GSK-3β活性與βcatenin磷酸化水平，且針刺有上調(diào)βcatenin磷酸化水平的作用，提示針刺能降低運(yùn)動(dòng)對(duì)Wnt/βcatenin信號(hào)通路的激活程度，表明針刺作為一種修復(fù)手段能減輕運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌造成的損傷，對(duì)骨骼肌損傷有良好的修復(fù)作用。

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