負(fù)重站立法建立骨骼肌靜力性損傷動物模型的實驗研究

摘 要：為建立影響因素簡單、接近生理狀態(tài)及可重復(fù)運動的骨骼肌靜力性損傷的動物模型，自制了負(fù)重站立訓(xùn)練實驗臺，選用雄性SD大鼠72只，隨機分為對照組、3 d～4周實驗組。將實驗組大鼠前肢固定，在其后肢踝關(guān)節(jié)處施加50%體重的負(fù)荷，進行跖屈位支撐站立，每天上、下午各訓(xùn)練1 h，觀察大鼠體重、腓腸肌常規(guī)組織學(xué)結(jié)構(gòu)、超微結(jié)構(gòu)以及血清CK和LDH活性的變化。結(jié)果表明，各實驗組體重均顯著低于對照組，腓腸肌常規(guī)組織學(xué)結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)均明顯改變，且隨訓(xùn)練時間的延長而更加顯著，實驗組血清CK和LDH活性亦顯著高于對照組。此模型肌纖維募集方式與自然狀態(tài)符合，影響因素少，運動的可重復(fù)性好。連續(xù)的靜力性負(fù)荷可產(chǎn)生對骨骼肌微觀結(jié)構(gòu)的累積性損害。

關(guān)鍵詞：骨骼肌；靜力性損傷；動物模型；負(fù)重站立

中圖分類號：G80453 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1007-3612（2012）10-0051-05

Experimental Research on Animal Model Building of Static Skeletal Muscle Injury through Loading Stand

LIU Ye

（Beijing Sport University， Beijing 100084， China）

Abstract：To establish animal model of static skeletal muscle injury which is closer to the physiological condition and repeatable movement， the researcher invented a rat training flat of loading stand. 72 male SD rats were randomly divided into control group and experimental group from 3 days to 4 weeks. It imposed the load of 50% rat’s body weight on the anckle of the rats and force the hindlimb plantar flexion support stand. To observe changes of body weight， histological structure and ultrastructure of gastrocnemius， CK and LDH activity of serum， each training lasted one hour in every morning and afternoon. Results： body weight of experimental groups was significantly lower than that of control group. Histological structure and ultrastructure of gastrocnemius were significantly changed， with the extension of training time and even more significant. CK and LDH activity of serum of experimental groups was significantly higher than that of control group. Conclusion： Continuous static load through loading stand will cumulatively damage microstructure of skeletal muscle. In this model， musclefibrin collecting mode correspond to natural condition， less subjoin factors impact and the movement can be repeated.

Key words：skeletal muscle； static injury；animal model；loading stand

近年來，隨著生產(chǎn)機械化、自動化、專業(yè)化程度的提高和計算機在社會生活中的廣泛應(yīng)用，由于長時間保持某種姿勢和體位導(dǎo)致的慢性肌肉靜力性損傷問題日趨突出[1，2]，嚴(yán)重影響人們正常的工作、學(xué)習(xí)和生活。因此，研究靜力性收縮所致肌肉損傷的機理對于預(yù)防和治療這種運動性損傷具有重要意義。以往研究通常采用電刺激造成肌肉等長收縮、肌肉剝離負(fù)重、動物抓桿懸掛以及固定籠固定等方式建立骨骼肌靜力性負(fù)荷所致?lián)p傷的動物模型[3，4，5，6]，分別存在肌纖維募集方式和肌肉工作性質(zhì)與自然生理狀態(tài)差別較大，附加影響因素過多等缺陷。本研究旨在建立影響因素簡單的、更接近生理狀態(tài)及可重復(fù)運動的動物模型，以期為骨骼肌靜力性負(fù)荷所致?lián)p傷的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物分組 健康純系雄性SD大鼠72只（8周齡），隨機分成對照組（CON）、4周實驗組（4周）、3周實驗組（3周）、2周實驗組（2周）、1周實驗組（1周）和3 d實驗組（3 d），每組12只，各組體重?zé)o顯著性差異。分籠飼養(yǎng)，適應(yīng)2 d后分別處置。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（22±2）℃，相對濕度為45%～55%，自然光照，自由飲食、飲水。實驗動物分組見表1。

1.2 大鼠靜力性運動實驗臺的設(shè)計 設(shè)計自制空心實驗臺，臺上安裝可調(diào)節(jié)高度的鐵架。鐵架橫梁表面有用以固定大鼠前肢的光滑凹槽。在鐵架下方臺面鉆3個圓孔，2孔在前，相距3 cm，其連線距鐵架橫梁投影線后5 cm并與之平行，用于施加負(fù)荷的砝碼通過而懸掛在大鼠踝關(guān)節(jié)上，同時起到固定大鼠后肢保持靜力性運動的作用；另1個孔在前面2孔連線中點后2 cm處，用于實驗中容納鼠尾，避免鼠尾支撐。

1.3 大鼠靜力性運動方式 實驗時將大鼠前肢固定在鐵架橫梁上，調(diào)節(jié)高度使其兩側(cè)后肢踝關(guān)節(jié)處于跖屈位支撐站立（以跖趾關(guān)節(jié)最大支撐不離開臺面為標(biāo)準(zhǔn)），并在兩側(cè)踝關(guān)節(jié)處各施加50%體重的負(fù)荷（圖1）。此種施加負(fù)荷方式可以保證雙側(cè)腓腸肌的肌纖維處于靜力性收縮的募集模式。每天上、下午各訓(xùn)練1 h，分別訓(xùn)練3 d、1周、2周、3周和4周。大鼠均在全部訓(xùn)練結(jié)束次日宰殺取材。對照組不訓(xùn)練，其它條件與實驗組相同。運動訓(xùn)練安排詳見表2。

1.4 取材和標(biāo)本制備

圖1 實驗大鼠的運動方式

1.4.1 取材 稱取體重，眼底取血，斷頭處死?？焖偃∽蠛笾枘c肌內(nèi)側(cè)頭中下部1/3處約0.5 cm×0.5 cm×1 cm肌組織，入4%中性多聚甲醛固定。在每組中隨機取3只動物左后肢腓腸肌同一位置約0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm組織塊，立即入3%戊二醛固定。制備血清，-80℃保存待測。

1.4.2 石蠟切片制備及HE染色 將4%中性多聚甲醛固定的肌組織塊經(jīng)脫水、透明后，石蠟包埋，橫向和縱向連續(xù)切片，厚度為5 μm。常規(guī)HE染色。

1.4.3 電鏡切片制備及染色 將3%戊二醛中固定的肌組織塊入0.18 mmol/L蔗糖緩沖液浸泡后沖洗，1%鋨酸固定，梯度丙酮脫水，浸酯后包埋。連續(xù)超薄切片，厚度為500～800 A°。醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色。

1.5 測試指標(biāo)與方法

1.5.1 腓腸肌常規(guī)組織學(xué)觀察 將HE切片置于OLYMPUSBX51型光學(xué)顯微鏡下，以10×40放大倍數(shù)取視野四角和中央共5個區(qū)域觀察。

1.5.2 腓腸肌透射電鏡觀察 將電鏡標(biāo)本置于JEM-100CX Ⅱ型電子顯微鏡下，以7 200～36 000倍對視野的四角和中央共5個區(qū)域進行觀察、拍照。

1.5.3 血清肌酸激酶（CK）和乳酸脫氫酶（LDH）活性的測定 采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒，嚴(yán)格按說明書進行操作。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理 數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，使用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行處理，采用單因素方差分析進行各組間的差異顯著性檢驗。顯著性水平為P﹤0.05。

2 實驗結(jié)果

2.1 大鼠體重的變化 由表3所示，施加靜力性負(fù)荷期間各實驗組體重均顯著低于對照組同時期體重（P<0.01），而且隨著時間的延長，這種趨勢更加顯著。4周組大鼠的體重在第1周內(nèi)幾乎沒有增加（P>0.01），其余時間也呈緩慢增加趨勢；3周組體重在第1周出現(xiàn)負(fù)增長（P<0.05），其余時間增長也極為緩慢；而2周組、1周組和3 d組體重在施加負(fù)荷期內(nèi)均持續(xù)負(fù)增長，且施加負(fù)荷結(jié)束時體重均顯著低于開始時（P<0.01）。

2.2 大鼠一般狀態(tài)的變化 大鼠在施加負(fù)荷前均神態(tài)安靜，對食物的反應(yīng)較敏感，受到捕捉時有明顯的逃避反應(yīng)。施加負(fù)荷時，大鼠明顯煩躁不安，訓(xùn)練后逃避反應(yīng)明顯下降，有些基本無逃避反應(yīng)，而且后肢肌肉觸感明顯較硬，不愿站立，需匍匐3～5 min才可行走。在施加負(fù)荷至第1周后，普遍出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、萎靡不振等現(xiàn)象。

2.3 腓腸肌常規(guī)組織學(xué)的變化 對照組的骨骼肌表現(xiàn)為肌膜清晰，肌纖維明暗條紋規(guī)則整齊，未見變性、壞死（圖2）。

3 d組可見與肌束膜連接處肌纖維細(xì)胞核增多，明顯的小片狀肌纖維溶解、壞死，肌膜模糊、不連續(xù)，大量淋巴細(xì)胞浸潤，間質(zhì)成纖維母細(xì)胞增生（圖3）。

1周和2周組表現(xiàn)相似，與肌束膜連接處肌纖維細(xì)胞核增多，肌纖維變性，肌膜模糊、不完整，但淋巴細(xì)胞浸潤和成纖維母細(xì)胞增生明顯減少（圖4、圖5）。

3周組可見多灶性肌纖維變性，局部肌纖維橫紋模糊，肌膜不完整，淋巴細(xì)胞浸潤和成纖維母細(xì)胞增生較1周和2周實驗組增多（圖6）。

4周組多見肌纖維變性，淋巴細(xì)胞浸潤和成纖維母細(xì)胞增生較明顯，局部肌纖維正常結(jié)構(gòu)完全喪失，肌膜模糊（圖7）。

2.4 腓腸肌超微結(jié)構(gòu)的變化

對照組的骨骼肌肌原纖維排列規(guī)則，A、I帶及Z線清晰整齊（圖7）。

3 d組與1周組骨骼肌超微結(jié)構(gòu)的變化主要是Z線出現(xiàn)異常，具體表現(xiàn)為鋸齒狀、斜坡狀（Z線流），局部Z線扭曲、斷裂，偶見肌絲扭曲、肌節(jié)錯位現(xiàn)象。2周、3周和4周組除上述異常現(xiàn)象外，還較常見肌絲排列紊亂、扭曲，肌節(jié)結(jié)構(gòu)模糊，無法區(qū)分A帶、I帶，甚至肌節(jié)斷裂、消失等現(xiàn)象。以上各種超微結(jié)構(gòu)的典型變化見附圖8～12。

2.5 血清肌酸激酶活性的變化 由表4可見，各實驗組大鼠血清肌酸激酶（CK）活性較對照組均顯著升高（P<0.01）。不同時間實驗組間的變化趨勢表現(xiàn)為3 d～1周時持續(xù)上升，1周～4周逐漸回落，其中第4周時與第1周相比有顯著性差異（P<0.05），其余各實驗組間均無顯著性差異。

2.6 血清乳酸脫氫酶活性的變化 由表4可見，各實驗組大鼠血清乳酸脫氫酶（LDH）活性與對照組相比均顯著升高（P<0.01）。不同實驗組間的變化趨勢表現(xiàn)為3 d時已達到一個峰值，1～3周明顯回落，與3 d組相比均有顯著性差異（P<0.05或 P<0.01），至第4周時又明顯升高，且與第1周和第2周時有顯著性差異（P<0.05）。

3 討 論

3.1 施加不同時間靜力性負(fù)荷對大鼠體重的影響 體重的下降常提示存在身體機能狀態(tài)下降和對外界刺激因素的不適應(yīng)[7]。本研究中各實驗組大鼠的體重在施加靜力性負(fù)荷前后的變化說明，在3 d～4周后肢負(fù)重站立的靜力性訓(xùn)練中，大鼠始終處于對施加負(fù)荷和運動方式的不適應(yīng)或勉強適應(yīng)狀態(tài)。大量研究表明，肌肉運動性損傷的直接誘因是肌肉受到不習(xí)慣或不適應(yīng)的負(fù)荷所致[8]。因此，本研究的運動負(fù)荷和運動方式對建立骨骼肌靜力性負(fù)荷所致?lián)p傷動物模型是適合的。

3.2 施加不同時間靜力性負(fù)荷對大鼠腓腸肌微觀結(jié)構(gòu)的影響 肌肉在進行靜力性收縮時與離心性和向心性收縮有不同的特征，此時肌肉不發(fā)生長度變化，但肌張力持續(xù)作用的時間較長，肌內(nèi)壓持續(xù)保持較高狀態(tài)，使肌肉血供和代謝產(chǎn)物排出產(chǎn)生障礙。由此提示，肌肉靜力性運動后微觀結(jié)構(gòu)的變化可能與離心性和向心性收縮方式所致變化有所不同。另外在實際工作和運動訓(xùn)練中，由于肌肉不適或酸痛而停止工作或訓(xùn)練的現(xiàn)象較少見，因此研究連續(xù)施加靜力性負(fù)荷對骨骼肌的影響比研究施加一次性靜力性負(fù)荷更具實際意義。

本研究的結(jié)果表明，施加3 d～4周靜力性負(fù)荷均使骨骼肌微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，而且3周和4周時淋巴細(xì)胞浸潤和成纖維母細(xì)胞增生較1周和2周時更明顯， 2～4周時超微結(jié)構(gòu)改變較3 d～1周時更嚴(yán)重。由于本實驗對大鼠后肢施加的是一種相對恒定的負(fù)荷，甚至在體重出現(xiàn)負(fù)增長時絕對負(fù)荷還有所降低，因此表明連續(xù)施加相同強度和負(fù)荷量的靜力性負(fù)荷可以產(chǎn)生對骨骼肌微觀結(jié)構(gòu)的累積性損害。

許多學(xué)者認(rèn)為運動性肌肉微損傷結(jié)構(gòu)的變化不具有累積性損害作用。Nosaka和Byrnes等均發(fā)現(xiàn)重復(fù)性離心訓(xùn)練并不影響首次訓(xùn)練后延遲性肌肉酸痛的恢復(fù)[9，10]。馬建等[11]對家兔進行4 d或7 d離心疲勞訓(xùn)練后發(fā)現(xiàn)，4 d時脛前肌纖維的變性、吞噬、間質(zhì)水腫和炎細(xì)胞浸潤程度均非常明顯，7 d時明顯減少或消失。分析以往研究與本研究結(jié)果存在差異的原因，我們認(rèn)為運動性肌肉微損傷結(jié)構(gòu)的變化是否具有累積性損害作用，并不僅僅決定于強度和負(fù)荷量，還與運動方式有關(guān)。勞動生理學(xué)的調(diào)查證明[12]，靜態(tài)負(fù)荷較動態(tài)負(fù)荷更容易引起肌肉的疲勞和損傷。本研究中大鼠一般狀態(tài)的表現(xiàn)和體重的變化趨勢，表明長時間、連續(xù)的靜力性運動是機體不易適應(yīng)的運動方式，因此導(dǎo)致骨骼肌微觀結(jié)構(gòu)的損傷和一定程度的累積。這可能與肌肉工作特征和代謝方式有關(guān)。由此提示機體長期、重復(fù)的處于某種強迫體位或進行維持某種固定姿勢的靜力性運動，可能是導(dǎo)致肌肉慢性損傷的潛在性因素。

另外，有研究認(rèn)為機械牽拉是離心性收縮所致肌肉損傷的始動因素，其中肌張力起主要作用[13，14]。本實驗中常規(guī)組織學(xué)的觀察可見與肌束膜連接處肌纖維細(xì)胞核增多，肌纖維變性在與肌束膜連接處也較常見，提示在骨骼肌長時間靜力性運動中，肌張力的持續(xù)作用可能是造成肌纖維損傷的重要因素。

3.3 施加不同時間靜力性負(fù)荷對大鼠血清肌肉酶活性的影響 正常生理狀況下血液中CK、LDH等肌肉酶的含量甚微。在運動過程中，由于肌膜易于受到損傷，導(dǎo)致通透性增加，使其進入血液，從而引起血中肌肉酶活性增高[13，14]。因此，它們在運動后含量的變化可以間接反映肌細(xì)胞的損傷。本研究觀察了施加不同時間靜力性負(fù)荷后大鼠血清CK和LDH活性的變化，希望從另一角度來檢驗?zāi)Ｐ偷慕⑹欠癯晒Α?/p>

本研究的結(jié)果表明，施加不同時間靜力性負(fù)荷后，大鼠血清CK和LDH活性與對照組相比均顯著升高，血清CK 3 d～1周時持續(xù)上升，1周后逐漸回落，至第4周時仍顯著高于對照組。血清LDH活性的變化趨勢與CK略有不同，具有雙相特征，表現(xiàn)為3 d時已達到一個峰值，1～3周明顯回落，至第4周時又明顯升高，且與第1周和第2周時有顯著性差異。

這表明施加靜力性負(fù)荷導(dǎo)致骨骼肌細(xì)胞膜損傷，其屏障作用減弱，通透性增加。這與以往多數(shù)研究結(jié)果一致[14，15]，且與本研究中組織學(xué)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)肌膜模糊、不連續(xù)的變化相符合，故從另一角度說明本模型的靜力性負(fù)荷造成了骨骼肌損傷。

然而，也有學(xué)者對用血清肌肉酶活性來評價肌肉損傷的作用提出了質(zhì)疑。Van Der Meulen[16]和Manfredi[17]均報道肌酸激酶的升高與活檢標(biāo)本肌內(nèi)是否損傷沒有聯(lián)系。上述研究的不同結(jié)果可能與采用的肌肉標(biāo)本不同有關(guān)。由于肌肉損傷僅限于肌肉內(nèi)的局部[18]，因此肌肉活檢時若未檢到這樣小范圍的損傷就可能造成研究結(jié)果的不同。

本研究中血清CK和LDH活性的變化與骨骼肌微觀結(jié)構(gòu)損傷的現(xiàn)象基本相符，但時相并不完全一致。這可能與骨骼肌并不是血清中肌肉酶的唯一來源有關(guān)。殷勁等[19]發(fā)現(xiàn)，家免在劇烈運動致疲勞后，血清中LDH的兩種同工酶LDHl及LDH5均升高，但來自骨骼肌的LDH5的活性低于心肌釋放的LDHl，很顯然該運動對心肌和骨骼肌均產(chǎn)生了影響。一般認(rèn)為，運動對機體的影響是多組織的而不是單一的，血清中CK、LDH在運動后的增加是多組織釋放的總效應(yīng)，因此造成它們活性的變化與骨骼肌微觀結(jié)構(gòu)損傷的時相不完全一致。據(jù)此本研究認(rèn)為血清CK和LDH可以作為反映靜力性負(fù)荷所致肌肉損傷的間接指標(biāo)。

綜上所述，本研究采用的持續(xù)3 d～4周的大鼠后肢負(fù)重站立的靜力性負(fù)荷導(dǎo)致骨骼肌發(fā)生了損傷，說明模型的建立是成功的。與以往模型相比，本模型在肌纖維募集方式、肌肉工作性質(zhì)與自然生理狀態(tài)的符合、較少的附加影響因素以及運動的可重復(fù)性等方面具有明顯的優(yōu)勢，因此更適合進行骨骼肌靜力性負(fù)荷所致?lián)p傷的發(fā)生、修復(fù)與再生機制的研究。

4 結(jié) 論

1）持續(xù)3 d～4周的大鼠后肢負(fù)重站立的靜力性負(fù)荷可誘發(fā)骨骼肌發(fā)生損傷，可用于骨骼肌靜力性負(fù)荷所致?lián)p傷的研究模型，此模型在肌纖維募集方式、肌肉工作性質(zhì)與自然生理狀態(tài)的符合、較少的附加影響因素以及運動的可重復(fù)性等方面具有明顯的優(yōu)勢。

2）同等強度和負(fù)荷量的連續(xù)的靜力性負(fù)荷可以產(chǎn)生對骨骼肌微觀結(jié)構(gòu)的累積性損害。

3）血清CK和LDH可以作為反映靜力性負(fù)荷所致肌肉損傷的間接指標(biāo)。

參考文獻：

[1] Matti V，Antti M，Jukka U，et al.Effectiveness of dynamic muscle training， relaxation training，or ordinary activity for chronic neck pain：randomised controlled trial[J] .BMJ，2003，327 （8） ：475-479.

[2] 黃勝山心理社會因素對職業(yè)性肌肉骨骼疾患的影響[J] .中華勞動衛(wèi)生職業(yè)病雜志，2006，4：51-53.

[3] 張培蘇被動收縮所致家兔肌肉早期僵硬及其超微結(jié)構(gòu)的變化[J] .中國運動醫(yī)學(xué)雜志，1988，7（1）：1-9.

[4] 宋敏.靜態(tài)負(fù)荷所致肌肉損傷的機理及生物標(biāo)志物的研究.北京醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文，1998：16.

[5] 王生，王起恩，等.強迫體位引起骨骼肌線粒體超微結(jié)構(gòu)變化的形態(tài)計量學(xué)研究[J] .北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1996，28（1）：62-64.

[6] 呂丹云等.股四頭肌和小腿三頭肌及其肌止裝置（包括髕骨與跟骨區(qū)域）慢性運動損傷的模擬實驗研究[J] .中國運動醫(yī)學(xué)雜志，1982，1（1）：14-19.

[7] Snyder.A.， Zierath.J.H.， et al. The effects of exercise mode， swimming vs. running， upon bone growth in the rapidly growing female rat[J] .Mechanisms of Ageing and Development， 1992， 66：59-69.

[8] Armstrong RB. Initial events in exerciseinduced muscular injury[J] .Med Sci Sports Exer.，1990，22（4）：429-435.

[9] Nosaka，K，Clarkson，P.M.Muscle damage following repeated bouts of high force eccentric exercise[J] .Med. Sci.Sports Exerc.，1995，27（9）：1263.

[10] Byrnes.W.C，Clarkson，P.M.Delayed onset muscle soreness and training[J] . Clin.Sports Med.， 1986，5（3）：605.

[11] 馬建，張世明，劉波.中醫(yī)外治方法對兔骨骼肌連續(xù)離心訓(xùn)練后形態(tài)學(xué)與組織病理學(xué)影響的實驗研究[J] .中國運動醫(yī)學(xué)雜志，2000，19（1）：19-24.

[12] Badley E.M.，et alThe economic burden of musculoskeletal disorders in Canada is similar to that for cancer and may be higher[J] ，Rheumotol， 1995，22（2）：204

[13] Nosaka K，et al.Concentric or eccentric training effect on eccentric exerciseinduced muscle damage[J] .Med Sci Sports Exerc.， 2002；34（1）：70-76.

[14] Balnave.C.D.，et al.Effect of training on eccentric exerciseinduced muscle damage[J] .Appl Physiol.， 1993， 75（4） ： 1545-1551.

[15] 魏源.運動性骨骼肌微損傷的特性.中國組織工程研究與臨床康復(fù)[J] ，2007，19：24-27

[16] Van Der Meulen.Relationship between exercise induced muscle damage and enzyme release in rats[J] .Appl Physiol.，1994，71： 999-1004.

[17] Manfredi. T.G. Plasma creattine dinase activity and exercise induced muscle damage in older men[J] .Med Sci Sports Exerc.，1991，23：1028-1034.

[18] 曲綿域，等.實用運動醫(yī)學(xué)[M] .北京：北京科學(xué)技術(shù)出版社，1996：431.

[19] 殷勁，等.劇烈運動致疲勞時不同組織LDH同工酶譜變化的研究[J] .中國運動醫(yī)學(xué)雜志，1991，10（3）：129-134.