乳鼠皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)改良方法及基本電生理特性研究

摘 要：目的：對(duì)原有乳鼠大鼠皮層神經(jīng)元的原代培養(yǎng)方法進(jìn)行改進(jìn)，獲得高質(zhì)量且體外存活時(shí)間更長(zhǎng)的神經(jīng)元，以期應(yīng)用于對(duì)細(xì)胞功能狀態(tài)要求高的相關(guān)研究。方法：多聚賴氨酸預(yù)處理培養(yǎng)皿，分離出生24 h之內(nèi)的SD大鼠大腦皮層神經(jīng)元，采用機(jī)械吹打與胰蛋白酶化學(xué)消化相結(jié)合的方法制備單細(xì)胞懸液，經(jīng)計(jì)數(shù)后以1×105 / mL的細(xì)胞密度接種。24 h后加阿糖胞苷（3 μg/mL）以抑制非神經(jīng)細(xì)胞過(guò)度增殖。培養(yǎng)3 d后將培養(yǎng)液全量換為添加B27的培養(yǎng)液。用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，并用膜片鉗單通道記錄法記錄BKCa通道電流。結(jié)果：對(duì)原有培養(yǎng)方法改進(jìn)后獲得可長(zhǎng)期存活的形態(tài)典型神經(jīng)元。在培養(yǎng)36 d時(shí)，用膜片鉗單通道記錄法仍能記錄到正常的BKCa通道電流。結(jié)論：該培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)，結(jié)果穩(wěn)定，可作為體外原代培養(yǎng)乳鼠神經(jīng)元的良好實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

關(guān)鍵詞：原代培養(yǎng)；皮層神經(jīng)元；乳鼠；膜片鉗；BKCa通道電流

中圖分類號(hào)：G8042 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-3612（2012）10-0042-05

A Modified Method for Primary Culture of Newborn Rat Cortical Neurons and Its Basic Electrophysiological Property

ZHAO Li， CHEN Yao， GONG Lijing， LU Yuanyuan

（Beijing Sport University， Beijing 100084， China）

Abstract：Objective：To modify previous method of primary newborn rat cortical neuron culture to get purer and more longlasting cells for some related studies. Methods：The cerebral cortices were aseptically removed from 024 hold SD rats and dissected out. Mechanical dissociation and trypsin digestion were combined to conduct monocell suspending media. The dissociated momocortical cells were diluted to 1×105/ml then to be plated on poly Llysinecoated petri dish. After 24h culture， 3μg/mL cytosine arabinoside （AraC） was added to the culture for 24 h to inhibit the outgrowth of glial cells. After three days postplanted， all media were removed from cultures and replaced with medium supplemented with B27. Then half of the culture medium was changed every three days. The morphological changes of neuron cells were observed by light microscope. Immunostaining of microtubuleassociated protein 2 （MAP2） was applied to assess the culture purity. Single channel current was recorded to evaluate the neurons properties by using patch clamp technique. Results： The improved method could increase the cells lifetime. On the 36th day， the primary culture was characterized by normal morphology and was gained typical BKca current. Conclusion：This is a simple and reliable technique for the in vitro primary culture of rat cortical neurons which have longtime livability and normal electrophysiological property.

Key words：primary culture， cortical neurons， newborn rat， patch clamp， BKca current

原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育特征與在體神經(jīng)元非常相似，且具有樣本均一性高，實(shí)驗(yàn)條件可控、相對(duì)恒定，影響因素單一，可有效排除諸多復(fù)雜因素（如體內(nèi)循環(huán)、體液、內(nèi)分泌、血腦屏障）等優(yōu)點(diǎn)，日益成為神經(jīng)科學(xué)研究中必不可少的實(shí)驗(yàn)材料及模型工具[1，2]。然而神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)與其他類型的細(xì)胞培養(yǎng)不同，正常神經(jīng)細(xì)胞只能增大而不能增殖，即只能原代培養(yǎng)，不能傳代，沒(méi)有細(xì)胞分裂現(xiàn)象，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)只會(huì)減少，不可能增加。目前一般認(rèn)為培養(yǎng)2～4周進(jìn)行實(shí)驗(yàn)比較適宜，4周后細(xì)胞就開(kāi)始退化[3]。而作為研究細(xì)胞電生理特性的膜片鉗技術(shù)既要保證細(xì)胞形態(tài)特征的完好，又要保存其生理學(xué)特征，才能供研究使用[4]。

本研究結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)原有的新生大鼠大腦皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)方法進(jìn)行改進(jìn)，并采用膜片鉗內(nèi)面向外模式記錄大電導(dǎo)鈣激活鉀通道（BKca）單通道電流，旨在建立一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、體外存活時(shí)間較長(zhǎng)且電生理特性正常的大鼠皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新生（< 24 h） SD大鼠，SPF級(jí)，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供。

1.2 試劑與溶液 EGTA，HEPES，L 多聚賴氨酸、阿糖胞苷、胰蛋白酶為Sigma公司產(chǎn)品；B-27 Supplement為Gibco公司產(chǎn)品；高糖DMEM，青霉素，鏈霉素為Hyclone公司產(chǎn)品；胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品；其他藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純。

解剖液（mM）：10 HEPES， 135 NaCl， 5 KCl， 1.3 Na2HPO4.12H2O， 0.2 KH2PO4， 8.8 glucose，105 sucrose， 調(diào)節(jié)pH 至7.3，0.22 μm孔徑濾膜過(guò)濾。DMEM完全培養(yǎng)液：89%高糖DMEM，10%胎牛血清，1%雙抗（青霉素 （100 U/mL） ，鏈霉素 （100 U/mL），經(jīng)0.22 μm孔徑濾膜過(guò)濾。谷氨酰胺在使用前加入到培養(yǎng)基，終濃度為2 mM。DMEM/B27完全培養(yǎng)液：87%高糖DMEM，10%胎牛血清，2% B-27 Supplement，1%雙抗（青霉素 （100 U/mL） ，鏈霉素 （100 U/mL） ），經(jīng)0.22 μm孔徑濾膜過(guò)濾。谷氨酰胺在使用前加入到培養(yǎng)基，終濃度為2 mM。電極內(nèi)液（mM）：100 KCl，2 CaCl2，10 HEPES，用NaOH調(diào) 節(jié)pH至7.2-7.4，充灌前經(jīng)0.22 μm濾膜進(jìn)行過(guò)濾。細(xì)胞外液（mM）：40 KCl，0.55 CaCl2，1 EGTA，10 HEPES和10 glucose，用KOH調(diào) 節(jié)pH至7.2～7.4。使用前經(jīng)0.22 μm濾膜進(jìn)行過(guò)濾。

1.3 培養(yǎng)皿的預(yù)處理 包被L多聚賴氨酸： 培養(yǎng)神經(jīng)元采用直徑為35 mm的一次性塑料培養(yǎng)皿（NUNC），在培養(yǎng)前用終濃度為50 Lg/ mL的L多聚賴氨酸包被培養(yǎng)皿，置于超凈工作臺(tái)內(nèi)（打開(kāi)皿蓋），紫外燈下照射2 h，回收多余液體。干燥后用DMEM沖洗兩遍備用。

1.4 培養(yǎng)方法 取出生后24 h的SD大鼠，用去離子水沖洗體表后，于75%醫(yī)用酒精中消毒，3～5 s后取出，移入超凈工作臺(tái)，在無(wú)菌環(huán)境下迅速取大腦，置于預(yù)冷的解剖液中。分離得到雙側(cè)皮層，用眼科鑷剔除腦膜及血管，剪碎后轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，并加入10倍體積的消化液（消化液為0.25%胰蛋白酶及解剖液（1∶1）的混合液），37℃水浴。采用二次消化的方法：每隔5 min輕晃離心管，使組織塊與胰蛋白酶充分接觸，10 min后用口徑適宜且管口光滑的吸管輕輕吹打十幾次，靜置，取上清液于另一離心管，用含血清的DMED完全培養(yǎng)液終止消化，經(jīng)200目尼龍濾網(wǎng)過(guò)濾獲得單細(xì)胞懸液。剩余組織塊加入適量消化液重復(fù)上述步驟。單細(xì)胞懸液 1 000 轉(zhuǎn)/min 離心10 min，倒去上清液后，加DMEM完全培養(yǎng)液重懸，臺(tái)酚藍(lán)染色計(jì)數(shù)后，以1×105 的細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)皿中，每皿2 mL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后加一次阿糖胞苷（3 μg/mL）以抑制非神經(jīng)細(xì)胞過(guò)度增殖。培養(yǎng)基改進(jìn)組在培養(yǎng)3 d后全量換為DMEM/B27完全培養(yǎng)液，之后每隔3 d半量換液；傳統(tǒng)培養(yǎng)基組每隔3 d半量換DMEM完全培養(yǎng)液。倒置相差顯微鏡（IX71-F22PH，Olympus，Japan）定期觀察培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。傳統(tǒng)培養(yǎng)基組的神經(jīng)元在培養(yǎng)至6 d時(shí)進(jìn)行單通道BKCa通道電流的記錄。培養(yǎng)基改進(jìn)組培養(yǎng)至36 d時(shí)進(jìn)行單通道BKCa通道電流記錄。

1.5 大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)觀察 細(xì)胞接種后定期在倒置相差顯微鏡下觀察神經(jīng)元生長(zhǎng)的情況，并應(yīng)用MAP2和Cy3免疫熒光雙標(biāo)染色，鑒定本方法培養(yǎng)的神經(jīng)元。

1.6 BKCa通道電流的記錄 實(shí)驗(yàn)在室溫（20～25℃）下進(jìn)行，將培養(yǎng)皿置于倒置相差顯微鏡載物臺(tái)中。記錄所用電極為薄壁硼硅玻璃電極毛細(xì)微管 （B15014F，ID：1.05 mm，OD：1.50 mm；Vital Sense Scientific Instruments，Wuhan），用電極拉制儀（PC10，Narishige，Tokyo） 兩步拉制，經(jīng)拋光儀 （MF-830，Narishige，Tokyo）拋光，電極尖端直徑約為1.5 μm。實(shí)驗(yàn)采用膜片鉗內(nèi)面向外模式進(jìn)行單通道記錄，細(xì)胞內(nèi)外液采用對(duì)稱性高K+（140 mM）方式。玻璃微電極充灌電極內(nèi)液后電阻為4～8 MΩ，給予電極一定正壓，用微操縱器控制電極入液。當(dāng)電極尖端接觸細(xì)胞表面時(shí)，緩慢給與負(fù)壓，即可見(jiàn)應(yīng)答電流下降直至為零，表明高阻封接形成。待封接穩(wěn)定，阻抗達(dá)10 GΩ以上，將電極提出液面，在空氣中暴露數(shù)秒，再入液，即形成內(nèi)面向外記錄膜片。電流信號(hào)經(jīng)膜片鉗放大器 [Multiclamp 700B，Axon（（MDC）] 放大，1～2 kHz低通濾波，經(jīng)模數(shù)/數(shù)模轉(zhuǎn)換器[Digidata-1440A，Axon（MDC）] ，由pClamp10記錄、儲(chǔ)存于計(jì)算機(jī)。采樣模式為Gap free，采樣頻率為2 kHz，8-極Bessel濾波1～3 kHz。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析 單通道數(shù)據(jù)經(jīng)Clampfit10.2分析程序自動(dòng)測(cè)量通道平均電流幅度（Am）、開(kāi)放概率（Po）、平均開(kāi)放時(shí)間（To）和 平均關(guān)閉時(shí)間（Tc）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)及曲線擬合等做統(tǒng)計(jì)處理。

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析，差異顯著性為P<0.05，非常顯著性為P<0.01。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 倒置相差顯微鏡觀察：接種后24 h，細(xì)胞已貼壁，胞體較小，呈圓形或橢圓形，折光性良好，分布均勻，有1～2個(gè)突起，但細(xì)胞間連接較少。經(jīng)MAP2和Cy3免疫熒光雙標(biāo)染色呈強(qiáng)陽(yáng)性，熒光顯微鏡觀察本方法培養(yǎng)的神經(jīng)元純度高達(dá)95%（圖1）。

圖1 MAP2標(biāo)記陽(yáng)性神經(jīng)元

培養(yǎng)3 d，細(xì)胞胞體增大較快，呈梭形或三角錐形，細(xì)胞間已形成稀疏的網(wǎng)絡(luò)（圖2A，圖2 a）。培養(yǎng)6 d，神經(jīng)細(xì)胞胞體增大，突起粗而長(zhǎng)，有單極、雙極、多極突起，細(xì)胞胞體飽滿，光暈明顯，已形成完整神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（圖2B，圖2b）?？梢?jiàn)兩組細(xì)胞在接種后前6 d細(xì)胞形態(tài)無(wú)顯著性差異，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的逐步延長(zhǎng)，采用傳統(tǒng)DMEM完全培養(yǎng)液的神經(jīng)元，在同一時(shí)間點(diǎn)，胞體較培養(yǎng)基改進(jìn)組小，

圖2 體外原代培養(yǎng)新生大鼠大腦皮層神經(jīng)元光鏡照片 400×

注：A，B，C，D分別為培養(yǎng)基改進(jìn)組3 d，6 d，20 d，36 d的神經(jīng)元。 a，b，c，d分別為傳統(tǒng)培養(yǎng)基組3 d，6 d，20 d，28 d的神經(jīng)元。

突起短，細(xì)，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成不明顯，細(xì)胞出現(xiàn)退行性改變的時(shí)間早。如在培養(yǎng)20 d時(shí)，傳統(tǒng)培養(yǎng)基組神經(jīng)元出現(xiàn)細(xì)胞聚集成團(tuán)，神經(jīng)元胞體內(nèi)顆粒增多，突起減少、縮短，神經(jīng)纖維退化等現(xiàn)象（圖2 c），而培養(yǎng)基改進(jìn)組在培養(yǎng)20 d時(shí)，細(xì)胞仍具有良好的光暈，致密的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)布滿皿底（圖2 C），在培養(yǎng)至36 d以后，神經(jīng)元才逐漸出現(xiàn)胞體折光性降低，突起減少、縮短等退行性變化（圖2 D）。而采用傳統(tǒng)DMEM完全培養(yǎng)液基的神經(jīng)元在培養(yǎng)至28 d時(shí)，已找不到形態(tài)完整的細(xì)胞（圖2 d）。

2.2 原代培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元BKCa單通道電流特性 原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元細(xì)胞膜上的單通道電活動(dòng)表現(xiàn)出明顯的電壓依賴性。隨膜電位去極化程度增大，單通道電流幅值增大，開(kāi)放概率顯著增加。在對(duì)稱性高鉀（140 mM）溶液中，浴液游離鈣濃度為2 μM時(shí)，內(nèi)面向外膜片下記錄的典型單通道電流（圖3）。對(duì)培養(yǎng)36 d的培養(yǎng)基改進(jìn)組神經(jīng)元6個(gè)膜片的單通道電流進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后，繪制IV曲線，獲取較大電導(dǎo)值（G）為（248.5±5.12）pS，反轉(zhuǎn)電位接近0 mV。對(duì)培養(yǎng)6 d的傳統(tǒng)培養(yǎng)基組神經(jīng)元6個(gè)膜片的單通道電流進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后，繪制IV曲線，獲取較大電導(dǎo)值（G）為（222.2±7.94）pS，反轉(zhuǎn)電位接近0 mV。兩組神經(jīng)元BKCa通道的電導(dǎo)值并無(wú)顯著性差異（P>0.05），且均符合BKCa通道大電導(dǎo)的特性[5]。

圖3 大鼠皮層神經(jīng)元BKCa通道電壓依賴性圖（A，a）和電導(dǎo)特性圖（B，b）

注：采用內(nèi)面向外單通道記錄模式。在對(duì)稱性高鉀（140 mM）溶液中，浴液游離鈣濃度為2 μM，IV曲線經(jīng)線性擬合。

圖3A、B為培養(yǎng)36 d的培養(yǎng)基改進(jìn)組神經(jīng)元BKCa通道特性圖，圖3ab為培養(yǎng)6 d的傳統(tǒng)培養(yǎng)基組神經(jīng)元BKCa通道特性圖。

對(duì)培養(yǎng)36 d的培養(yǎng)基改進(jìn)組神經(jīng)元BKCa通道進(jìn)行藥理學(xué)鑒定：內(nèi)面向外記錄模式下，浴液鈣離子濃度為2 mM時(shí)，形成內(nèi)面向外記錄模式后，將膜電位鉗于+40 mV下，記錄10 min，觀察通道開(kāi)放情況。如圖4A所示 ，形成內(nèi)面向外模式之初，通道開(kāi)放頻率很高，加入60 mmol/L鉀通道特異性阻斷劑四乙胺（TEA）后，通道開(kāi)放在5 min后基本被阻斷（圖4B）。這種電流能被胞內(nèi)較高濃度的鉀通道阻斷劑TEA所阻斷，表明該通道電流為鉀電流。

圖4 TEA對(duì)培養(yǎng)36 d的培養(yǎng)基改進(jìn)組神經(jīng)元 BKCa通道的阻斷作用

注：采用內(nèi)面向外單通道記錄模式。膜電位鉗為+40 mV，浴液鈣離子濃度為2 mM。A為加入TEA之前，B為加入60 mmol/L的TEA后5 min記錄的電流。

在膜電位為+40 mV時(shí)，當(dāng)浴液中鈣離子濃度由0.1 mM增加至2 mM時(shí)，培養(yǎng)36 d的培養(yǎng)基改進(jìn)組神經(jīng)元BKCa通道開(kāi)放概率由0.011±0.007增加至0.276±0.039 2（P<0.01，n=6），并且同時(shí)通道開(kāi)放時(shí)間明顯延長(zhǎng)，關(guān)閉時(shí)間明顯縮短，通道開(kāi)放水平增加，表明鈣離子對(duì)該通道有明顯的激活作用。

注：Em：+40mV，浴液鈣離子濃度為2 mM。

3 討 論

應(yīng)用培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞作為神經(jīng)科學(xué)研究的工具已經(jīng)是包括細(xì)胞功能，神經(jīng)發(fā)育，退行性疾病等在內(nèi)多領(lǐng)域，多層次研究的基本手段。而從細(xì)胞形態(tài)和電生理特性觀察體外獲得的神經(jīng)元特征是判斷細(xì)胞是否因培養(yǎng)條件改變特性，從而能否應(yīng)用該細(xì)胞進(jìn)行深入研究的前提。

3.1 取材對(duì)象和方法的選擇 本實(shí)驗(yàn)采用出生24 h之內(nèi)的SD乳鼠作為取材原料，采用機(jī)械吹打和低濃度、較長(zhǎng)時(shí)間胰蛋白酶消化相結(jié)合的方法，經(jīng)兩次消化，可獲得數(shù)量大，狀態(tài)優(yōu)，形狀穩(wěn)定的神經(jīng)元。 一般來(lái)講，胚胎神經(jīng)元形態(tài)學(xué)分化與化學(xué)分化程度較低，體外存活能力強(qiáng)，且神經(jīng)元之間的聯(lián)系較少，易于成功培養(yǎng)[2，6]。但不同部位組織的培養(yǎng)及用于不同培養(yǎng)目的時(shí)其最佳胚齡也有不同，而這些對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的成活是至關(guān)重要的[7]。與選用胎齡為15～18 d的胎鼠神經(jīng)元做體外培養(yǎng)相比，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的出生24 h之內(nèi)的SD乳鼠不存在胎齡難以確定的問(wèn)題。同時(shí)取材過(guò)程中采取的輕柔的機(jī)械消化與低濃度酶消化相結(jié)合的方法，對(duì)神經(jīng)元損害小。

3.2 培養(yǎng)基的選擇 神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基主要有血清培養(yǎng)基和無(wú)血清培養(yǎng)基2種。前者可以提供神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)成分，促進(jìn)細(xì)胞的增殖，但也為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、前體細(xì)胞等雜質(zhì)細(xì)胞提供了豐富的營(yíng)養(yǎng)，間接影響了神經(jīng)元的純度和生長(zhǎng)。后者可抑制非神經(jīng)元細(xì)胞的增殖，使神經(jīng)元保持較好的細(xì)胞活性及生理特性[6，8]。然而無(wú)血清培養(yǎng)液如Neurobasal價(jià)格昂貴，不利于長(zhǎng)期大量培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)在接種時(shí)使用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，保證神經(jīng)元生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)。在接種后24 h加阿糖胞苷抑制非神經(jīng)元的增殖，提高神經(jīng)元的純度。3 d后第一次換液時(shí)，全量換為含2%B27，10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，B27中含有神經(jīng)元生長(zhǎng)所必須的多種生長(zhǎng)因子和微量元素，可以保證神經(jīng)元長(zhǎng)期健康生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)。

3.3 原代培養(yǎng)乳鼠皮層神經(jīng)元電生理特性 膜片鉗技術(shù)廣泛應(yīng)用于神經(jīng)細(xì)胞電生理研究，目前已成為一種常規(guī)方法。該技術(shù)的關(guān)鍵是需獲得具有正常生理或病理特征，狀態(tài)優(yōu)良的細(xì)胞，且作為用于膜片鉗實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞，要求無(wú)污染，細(xì)胞狀態(tài)良好，細(xì)胞膜光滑無(wú)雜質(zhì)，通道蛋白表達(dá)正常[5]。在體外原代培養(yǎng)單個(gè)神經(jīng)細(xì)胞，通過(guò)對(duì)其電生理特性的觀察，可判斷神經(jīng)細(xì)胞是否因機(jī)械與化學(xué)法分離，或者因培養(yǎng)條件變化而改變了它的生理特性，從而考慮其能否用于藥理及其他深入研究。

大電導(dǎo)鈣激活鉀通道（BKCa）是鈣激活鉀通道家族的一個(gè)重要成員，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。其門控機(jī)制表現(xiàn)為對(duì)胞內(nèi)鈣濃度的敏感性和對(duì)膜電位的依賴性，即BKCa通道在膜去極化或胞內(nèi)Ca2+升高時(shí)激活，引發(fā)外向鉀電流，產(chǎn)生后超極化電位（after hyperpolarization potential， AHP），降低膜興奮性，從而減少神經(jīng)元電活動(dòng)，對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)釋放和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)功能具有重要的調(diào)節(jié)作用[9，10]。大量研究表明，BKCa通道的功能狀態(tài)與細(xì)胞狀態(tài)密切相關(guān)[11]。

一般體外培養(yǎng)的神經(jīng)元存活約4周，在約3周時(shí)可觀察到神經(jīng)元退化，出現(xiàn)胞體顆粒增多，立體感下降，光暈減弱，神經(jīng)纖維退化等變化。與之前報(bào)道體外培養(yǎng)神經(jīng)元生存時(shí)間相比，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用改良的培養(yǎng)基培養(yǎng)神經(jīng)元至36 d時(shí)，對(duì)其進(jìn)行電生理特征測(cè)試，記錄到BKCa通道電流，其通道特性如大電導(dǎo)，電壓敏感性，鈣敏感性，TEA對(duì)通道的特異性阻斷以及通道動(dòng)力學(xué)等均符合BKCa的基本特征[4，9，10]，并與培養(yǎng)6 d的神經(jīng)元BKCa通道電流特性相比無(wú)變異。表明在此培養(yǎng)條件下原代培養(yǎng)可存活至5周以上，且細(xì)胞狀態(tài)良好。

4 結(jié) 論

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)對(duì)原有培養(yǎng)方法改進(jìn)后延長(zhǎng)了從獲得成熟神經(jīng)細(xì)胞到神經(jīng)元退化之間的時(shí)間，使體外原代培養(yǎng)神經(jīng)元生存期延長(zhǎng)，且形態(tài)學(xué)和生理學(xué)特征完好，從而使可用于生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的時(shí)間延長(zhǎng)，值得推廣應(yīng)用。

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