堿性磷酸酶（AKP）的特性分析研究

摘要：堿性磷酸酶（AKP）是在堿性條件下水解多種磷酸酯并具有轉(zhuǎn)磷酸基作用的一組酶，并且在較高溫度下仍具有活性。本實(shí)驗(yàn)由含pET21a-AKP表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌制備堿性磷酸酶，通過一系列分離純化的實(shí)驗(yàn)提純了堿性磷酸酶。本實(shí)驗(yàn)通過對純化之后的AKP進(jìn)行酶促反應(yīng)速率曲線的測定、測定激活劑和抑制劑對AKP活性的影響、測定抑制劑對酶的動力學(xué)參數(shù)的影響、測定AKP的最適溫度和pH以及AKP的變性和復(fù)性等實(shí)驗(yàn)來研究AKP的特性。

關(guān)鍵詞：堿性磷酸酶（AKP）； 反應(yīng)速率曲線；激活劑；抑制劑；變性；復(fù)性；酶活力大腸桿菌堿性磷酸酶（ EC. 3. 1. 3. 1）， 是同二聚體金屬酶，能催化非特異性磷酸單酯水解，分子量是56 Kda。它的兩個單體結(jié)合成具有兩個活性中心的對稱的活性酶，每個活性中心包含3 個金屬原子，即兩個鋅原子和一個鎂原子。大腸桿菌堿性磷酸酶被phoA 基因編碼，和其他分泌蛋白質(zhì)一樣，以在氨基末端帶有一個信號肽的前體合成，轉(zhuǎn)錄后穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，信號肽被除去，兩個成熟的單體二聚化。

堿性磷酸酶即AKP來源廣泛，可來源于細(xì)菌、真菌、藻類、無脊椎動物及脊椎動物。AKP廣泛存在于各種生物體內(nèi)，參與細(xì)胞磷代謝和信號肽轉(zhuǎn)導(dǎo)的一種磷酸酶。

AKP能催化除去DNA、RNA、三磷酸核糖核苷和三磷酸脫氧核糖核苷的5’磷酸基團(tuán)；去除線狀DNA兩端的5’磷酸可以最大限度地減少質(zhì)粒DNA的自身環(huán)化；蛋白質(zhì)的去磷酸化。大腸桿菌堿性磷酸酶是一種有用的工具酶，在免疫學(xué)研究中常用作酶聯(lián)試劑，將AKP與顯色劑或去磷酸化后能發(fā)光的底物相互作用來揭示靶與檢測酶復(fù)合物的存在。AKP作為一種工具酶在表位連鎖圖譜、組織化學(xué)、免疫印跡、突變分析等方面有廣泛應(yīng)用，在臨床上作為同工酶，疾病診斷，研究磷的代謝等。

本實(shí)驗(yàn)對堿性磷酸酶的特性研究主要是通過對酶活力的測定來分析的。酶活性也

稱為酶活力，按照國際酶學(xué)委員會的規(guī)定，1個酶活力國際單位是指在最適反應(yīng)條件（指最適pH、溫度25℃等）下，1分鐘內(nèi)能催化1微摩爾底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量。酶活力的大小可以用在一定條件下所催化的化學(xué)反應(yīng)的速率來表示，反應(yīng)速率愈快，就表明酶活力愈高。酶催化的反應(yīng)速率可用單位時(shí)間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來表示，實(shí)際酶活測定中一般以測定產(chǎn)物的增加量為準(zhǔn)。AKP活力的測定是以pNPP為底物，采用分光光度計(jì)法來測定AKP的活力的。

一、材料與方法

1.酶促反應(yīng)的速率曲線的測定：

1.1材料：由AKP分離純化實(shí)驗(yàn)中制備的AKP溶液

1.2試劑：測活液（50mmol/L Tris-HCl pH 8.5，0.2mg/mL BSA，10mmol/L pNPP，2mmol/L MgAc2，pH= 8.5）、酶稀釋液（50mmol/L Tris-HCl，0.2mg/mL BSA，pH=8.5）、終止液（0.5mol/L Na3PO4，10mmol/L EDTA）

1.3儀器：試管；試劑瓶；藥匙；移液槍；玻棒；水浴鍋；分光光度計(jì)；比色杯；燒杯；分析天平；小指管；

1.4實(shí)驗(yàn)方法：

1.4.1確定AKP的最佳稀釋倍數(shù)。將酶分別稀釋不同倍數(shù)，在30℃水浴鍋中與測活液反應(yīng)10min，測溶液在410nm處的吸收峰，取吸光度值為0.7—0.9之間的稀釋倍數(shù)。

1.4.2 AKP特性分析一-酶促反應(yīng)的速率曲線測定。用已測的倍數(shù)稀釋酶，與測活液在30°C分別反應(yīng)0，3，6，9，12，15，18，21，24，30分鐘，測溶液在410nm處的吸收值。每個反應(yīng)測兩次，求平均值。以吸光度A410為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制時(shí)間作用曲線。

2.pH對AKP的酶活性的影響：

2.1材料：由AKP分離純化實(shí)驗(yàn)中制備的AKP溶液

2.2試劑：測活液（50 mmol/ L Tris-HCl，pH=7.5，8.5，9.5；50mmol/ L Caps-NaOH，pH=9.5，10.5，11.5）

2.3儀器：試管；試劑瓶；藥匙；移液槍；玻棒；水浴鍋；分光光度計(jì)；比色杯；燒杯；分析天平；小指管；

2.4實(shí)驗(yàn)方法：30℃條件下，分別在pH為7.5、8.5、9.5的50 mmol/ L Tris-HCl （含2 mmol/ LMgCl2）緩沖液配制的測活液及pH為9.5、10.5、11.5的50 mmol/ L Caps-NaOH （含2 mmol/ L MgCl2）緩沖液配制的測活液，反應(yīng)10min后，在410nm波長下測定AKP催化pNPP水解的吸光度值。

3.溫度對AKP的酶活性的影響：

3.1材料：由AKP分離純化實(shí)驗(yàn)中制備的AKP溶液

3.2試劑：測活液（50 mmol/ L Tris-HCl，pH=7.5，8.5，9.5；50mmol/ L Caps-NaOH，pH=9.5，10.5，11.5）

3.3儀器：試管；試劑瓶；藥匙；移液槍；玻棒；水浴鍋；電磁爐；分光光度計(jì)；比色杯；燒杯；分析天平；小指管；

3.4實(shí)驗(yàn)方法：測活液在50mmol/L Tris-HCl （含2mmol/ LMgCl2）緩沖中液配制而成，pH=8.5，分別在溫度為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃和100℃條件下反應(yīng)10min，在410nm波長下測定AKP催化pNPP水解的吸光度值。

二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.AKP的時(shí)間作用曲線：

表1 測活液ul360稀釋液ul40AKP ul4030℃反應(yīng)時(shí)間 min時(shí)間梯度 終止液ml3.6A 410（1） A 410（2）平均值時(shí)間設(shè)定為0、3、6、9、12、15、18、21、24min， A 410 的平均值是0、0.058、0.227、0.356、0.473、0.632、0.636、0.659、0.708、0.932。2.不同溫度對AKP的酶活性的影響：

表2測活液ul360稀釋液ul40AKP ul40反應(yīng)時(shí)間min10 終止液ml3.6A 410（1） A 410（2）平均值反應(yīng)溫度設(shè)定梯度：30、40、50、60、70、80、90、100℃。A 410 的平均值是0.152、0.34、0.409、0.5515、0.576、0.799、0.44、0.103。

3.不同pH對AKP的酶活性的影響：

表3測活液ul360稀釋液ul40AKP ul40反應(yīng)時(shí)間min10 終止液ml3.6A 410（1） A 410（2）平均值pH設(shè)定梯度：7.5、8.5、9.5、9.5、10.5、11.5。A 410 的平均值是0.3395、0.375、0.4645、0.367、0.3035、0.603。

三、討論

酶催化的反應(yīng)速率通常用單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物的增加量來表示。隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)行，產(chǎn)物的變化量也在發(fā)生改變。因此特定條件下，酶促反應(yīng)速率只在一定的時(shí)間范圍內(nèi)保持恒定，也只有此時(shí)的反應(yīng)速率（初速率，v0）才能真正體現(xiàn)酶的活力。在具體的實(shí)驗(yàn)中，可以通過酶促反應(yīng)的時(shí)間作用曲線來尋找v0，以便確定酶促反應(yīng)的特定條件。由圖可知，酶促反應(yīng)的速率（即圖象的斜率）是隨著反應(yīng)時(shí)間的增大而減小的，與預(yù)期結(jié)果相符。

就理論而言，酶是蛋白質(zhì)，具有許多可解離的極性基團(tuán)，在不同的酸堿環(huán)境中，這些基團(tuán)的解離狀態(tài)不同，所帶電荷不同，而它的解離狀態(tài)對保持酶的結(jié)構(gòu)，底物與酶的結(jié)合能力以及催化能力都有重要作用，因此溶液的pH對酶活性影響很大。若其他條件不變，酶只有在一定的pH范圍內(nèi)才能表現(xiàn)催化活性且在某一pH時(shí)，酶的催化活力最大，此pH稱為酶的最適pH。正常情況下，所測得的酶活性隨pH值的變化情況為一鐘罩形曲線，曲線的頂點(diǎn)即為該酶的最適pH值。有研究表明，大腸桿菌堿性磷酸酶的最適pH值為9.5～10.5。顯然我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不理想。本來可以看出最適pH為9.5，但是后來在pH為11.5時(shí)，酶的活力又增強(qiáng)了分析原因?yàn)閴A性磷酸酶本身出現(xiàn)了問題，或者是被污染，或者是產(chǎn)生了變異。

化學(xué)反應(yīng)速度一般隨溫度的升高而加快，但在酶促反應(yīng)中，隨著溫度的升高，蛋白質(zhì)的變性速度也在加快，因此在酶催化的反應(yīng)中，升高溫度既可以使反應(yīng)速度加快，同時(shí)又會引起酶的失活而降低反應(yīng)速度，只有在某一溫度時(shí)，酶促反應(yīng)的速度最大，此時(shí)的溫度稱為酶作用的最適溫度。需要注意，體外實(shí)驗(yàn)時(shí)，酶作用的最適溫度不是一個恒定不變的常數(shù)，而與反應(yīng)時(shí)間有關(guān)，這說明酶的最適溫度只是在一定條件下才有意義。（作者單位：菏澤學(xué)院）

參考文獻(xiàn)：

[1]《高級生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)講義》，生命科學(xué)與技術(shù)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心。

[2]《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》，魏群主編，高等教育出版社