柱穗山羊草α—醇溶蛋白基因的克隆與序列分析

摘 要：根據(jù)已知的普通小麥α-醇溶蛋白基因序列設(shè)計引物，采用PCR方法克隆基因并進行序列分析。從柱穗山羊草Y127中克隆得到1個α-醇溶蛋白基因序列Gli2-Z-2，它具有α-醇溶蛋白基因的典型結(jié)構(gòu)特征，編碼區(qū)全長939 bp，編碼313個氨基酸。氨基酸序列比較顯示，Gli2-Z-2在多聚谷氨酰胺區(qū)比已報道的α-醇溶蛋白序列有較多的谷氨酰胺殘基。

關(guān)鍵詞：柱穗山羊草；α-醇溶蛋白基因；基因克?。恍蛄蟹治?/p>

中圖分類號：Q785 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2012）10-0007-04

小麥籽粒的加工品質(zhì)受多種因素影響， 其中籽粒貯藏蛋白的組成和含量起重要作用[1]。小麥籽粒貯藏蛋白的主要組成成分是麥醇溶蛋白和麥谷蛋白， 其中醇溶蛋白是胚乳中產(chǎn)生的小麥種子儲藏蛋白的主要類型，與面團特性高度相關(guān)[2，3]，在組成上以單體形式存在，具有高度的異質(zhì)性和復(fù)雜性[4]，富含脯氨酸和谷氨酰胺，對面團物理特性有重要作用[5]。根據(jù)在SDS-PAGE上的遷移率可將醇溶蛋白分為α、β、γ 和ω 4 類，除ω-醇溶蛋白沒有半胱氨酸（Cys）不能形成二硫鍵外，其余均能形成分子內(nèi)二硫鍵。α-麥醇溶蛋白多肽富含硫，分子量約為30～45 ku，由第6 部分同源染色體短臂上的Gli-2位點編碼，而其余小麥醇溶蛋白基因位于第1部分同源染色體短臂上[6]。在4種醇溶蛋白類群中，α-醇溶蛋白含量最豐富，占小麥種子儲藏蛋白的15%～30%，是人類消費量最大的蛋白質(zhì)。

柱穗山羊草（Ae.cylindrica Host，CCDD， 2n=x=14） ， 屬于禾本科（Poaceae） 小麥族（Triticeae Dumort） 山羊草屬（Ae. gilops L.） 柱穗山羊草組（Cylindropyrum），分布在法國南部、意大利、南斯拉夫、匈牙利、羅馬尼亞、保加利亞、阿爾巴尼亞、希臘、俄羅斯南部、阿富汗、伊朗、伊拉克北部、土耳其和敘利亞。由粗山羊草與尾狀山羊草天然雜交進化而來， 由于長期的自然進化， 蘊涵大量遺傳資源， 是小麥育種材料的補充[7]。由于α-醇溶蛋白基因的克隆在柱穗山羊草中報道較少，本研究旨在從柱穗山羊草中分離α-醇溶蛋白基因，并對其進行序列分析，研究α-醇溶蛋白在小麥及其近緣屬種中的進化關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為柱穗山羊草Y127，由中國國家種質(zhì)庫提供。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 植物總DNA的提取采用CTAB法[8]。

1.2.2 PCR 引物設(shè)計和基因組DNA擴增 根據(jù)已報道的α-醇溶蛋白基因序列，設(shè)計了一對可擴增α-醇溶蛋白基因完整編碼區(qū)的引物：正向引物PF（5′-ATGAAGACCTTTCTCATCCTTG-3′）和反向引物PR（5′-TCAGTTA/GGTACCG/AAAGATGCC-3′，“/”表示簡并），分別位于醇溶蛋白基因編碼區(qū)的起始端和終止端。PCR 反應(yīng)總體積為50 μl，其中含10×buffer 5 μl、1.5 mmol/L MgCl2、4種dNTP各200 μmol/L、引物各150 ng、Taq plus DNA polymerase（高保真）1.5 U、基因組DNA 100 ng。PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性4 min；然后94℃變性45 s，63.8℃退火1 min，72℃延伸45 s，共30個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。

1.2.3 PCR產(chǎn)物回收純化、T-載體克隆與陽性克隆篩選 PCR擴增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上檢測，將目的片段回收純化后連接到pEASY-T1載體上，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中。對白色菌落進行PCR擴增，確認陽性克隆。

1.2.4 序列測定與比較分析 DNA測序由華大基因公司完成，序列分析利用NCBI 網(wǎng)站和DNAman進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR 擴增、目的片段回收與克隆

用引物PF、PR對Y127基因組總DNA進行PCR擴增，在1%瓊脂糖凝膠上分離，檢測出一條900 bp左右的帶。將目的片段回收純化后，連接到pEASY-T1載體上。對白斑進行PCR擴增，確認為陽性克隆后進行測序，得到1個新的基因序列，命名為Gli2-Z-2（圖1）。

2.2 Gli2-Z-2核苷酸序列分析

將從Y127中克隆得到的醇溶蛋白基因序列Gli2-Z-2在NCBI網(wǎng)站上進行核苷酸序列檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與已知醇溶蛋白基因序列存在較高的相似性，相似度在80%左右。Gli2-Z-2的完整編碼區(qū)全長為939 bp，可翻譯成含313個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。

2.3 Gli2-Z-2氨基酸序列分析

對于Gli2-Z-2氨基酸結(jié)構(gòu)而言，包含由20個氨基酸殘基組成的相對保守的信號肽（MKTFLILALLAIVATTATTA），隨后是由5個串聯(lián)重復(fù)短肽（12肽）組成富含谷氨酰胺和脯氨酸的N端重復(fù)區(qū)，多聚谷氨酰胺Ⅰ區(qū)和特征區(qū)Ⅰ、多聚谷氨酰胺Ⅱ區(qū)和特征區(qū)Ⅱ，具有典型的α-醇溶蛋白序列的特點。

將克隆到的Gli2-Z-2基因與從NCBI網(wǎng)站上檢索到的8個α-醇溶蛋白基因進行氨基酸序列比對分析（圖2），結(jié)果顯示：8個α-醇溶蛋白基因分別來源于栽培一粒小麥（ACJ76944）、烏拉爾圖小麥（AFF27491）、野生二粒小麥（AFH74446、AFH74439、 AFH74444、AAZ73729）、單芒山羊草（AEW46744）和粗山羊草-黑麥雜種后代（AFD33733），與其它α-醇溶蛋白的N端重復(fù)區(qū)相比，在Gli2-Z-2的56、76、78位上分別為Q（谷氨酰胺）、P（脯氨酸）、P（脯氨酸），其余基因在這幾個位點上則分別為P（脯氨酸）、L（亮氨酸）、L（亮氨酸）。在所比較的9個序列中，重復(fù)區(qū)差異較大的為AEW46744和AFD33733，較其他序列分別有一段額外的QLLYPQP和QLPYPQL序列。在多聚谷氨酰胺Ⅰ區(qū)，Gli2-Z-2 較其他序列多PISQ四個氨基酸殘基；而在多聚谷氨酰胺Ⅱ區(qū)，Gli2-Z-2則比AEW46744多出10個Q（谷氨酰胺），比其他序列多12個Q（谷氨酰胺）。另外，在特征Ⅱ區(qū)，Gli2-Z-2比其他序列多出ST兩個氨基酸殘基。

注：ACJ76944，栽培一粒小麥；AEW46744，單芒山羊草；AFD33733，粗山羊草-黑麥的雜種后代；

AFF27491，烏拉爾圖小麥；AAZ73729、AFH74439、AFH74444、AFH74446，野生二粒小麥。下圖同。

2.4 α-醇溶蛋白序列聚類分析

將從柱穗山羊草中得到的α-醇溶蛋白序列與其他α-醇溶蛋白序列進行同源聚類分析發(fā)現(xiàn)，各序列間變異較小，可劃分為兩類，Gli2-Z-2未與其他α-醇溶蛋白聚為一類，而是單獨一類（圖3）。聚為一類的基因大多來源于相同的物種或含有相同基因組的不同物種，由此可以看出，醇溶蛋白基因是隨物種的進化或者染色體組的進化一同進化的。

小麥族植物種子醇溶蛋白位點上存在大量的等位性變異， 已被廣泛運用于品種鑒定、遺傳資源評價和遺傳多樣性分析[9，10]。對不同類型的醇溶蛋白基因結(jié)構(gòu)的解析發(fā)現(xiàn)，它們均具有保守的結(jié)構(gòu)， 因而有利于對種子醇溶蛋白家系進行分離與序列分析工作。本研究根據(jù)已報道的α-醇溶蛋白基因序列，設(shè)計了一對可擴增α-醇溶蛋白基因完整編碼區(qū)的引物， 從柱穗山羊草中克隆到了一個α-醇溶蛋白基因。該基因與已克隆的α-醇溶蛋白基因存在較大差異，尤其是較其他序列在多聚谷氨酰胺區(qū)多出10～12個谷氨酰胺殘基。聚類分析發(fā)現(xiàn)，α-醇溶蛋白基因的進化與其來源關(guān)系密切，其進化可能是伴隨著基因組的進化同時進行的。由于該基因未與其他基因聚為一類，推測該基因可能來源于C基因組，該推測有待于進一步驗證。

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