豬波形蛋白對(duì)PRRSV感染Marc—145細(xì)胞的抑制作用

摘 要：為了研究波形蛋白在介導(dǎo)豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）感染細(xì)胞過(guò)程中的作用，利用RT-PCR方法從PRRSV非易感細(xì)胞系豬腎細(xì)胞系PK-15細(xì)胞中擴(kuò)增目的基因，克隆入pET-28a（+）載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)的重組豬波形蛋白經(jīng)SDS-PAGE和Western blot鑒定和純化后免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體。利用病毒抑制試驗(yàn)檢測(cè)重組豬波形蛋白及多克隆抗體在PRRSV感染Marc-145細(xì)胞過(guò)程中的作用。結(jié)果表明，成功擴(kuò)增豬波形蛋白基因并克隆入pET-28a載體，經(jīng)誘導(dǎo)后得到高效表達(dá)，純化后免疫兔子產(chǎn)生高價(jià)血清抗體（105）。病毒阻斷結(jié)果表明，豬波形蛋白及多克隆抗體均能阻斷PRRSV感染Marc-145細(xì)胞。 這為以波形蛋白為基礎(chǔ)的PRRSV 受體阻斷抑制劑的研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征病毒；波形蛋白；病毒抑制；受體阻斷

中圖分類(lèi)號(hào)：Q939.91 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2012）10-0001-07

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus， PRRSV）能引起豬繁殖與呼吸綜合征（ PRRS），俗稱(chēng)豬藍(lán)耳病。臨床表現(xiàn)為母豬晚期流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎和木乃伊胎等繁殖障礙和各年齡豬群的呼吸道癥狀。該病于1996年在我國(guó)首次報(bào)道[1]，給我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

波形蛋白廣泛存在于間充質(zhì)細(xì)胞及中胚層來(lái)源的細(xì)胞中，主要與維持細(xì)胞及細(xì)胞器形態(tài)、參與有絲分裂和細(xì)胞分化、促進(jìn)細(xì)胞粘附和移行、創(chuàng)傷愈合、信號(hào)傳導(dǎo)、移植免疫和細(xì)胞凋亡等有關(guān)[2～4]。波形蛋白除了穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)之外，還與其他的細(xì)胞骨架纖維一起參與許多病毒的侵入或感染過(guò)程，例如Ⅰ型皰疹病毒[5]、藍(lán)舌病毒[6]、非洲豬高熱病毒[7]、人的呼吸道合胞病毒[8]、痘病毒[9]、泰勒氏小鼠腦脊髓炎病毒[10]和日本腦炎病毒[11，12]等。

PRRSV通過(guò)細(xì)胞表面受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用感染易感細(xì)胞，從而在細(xì)胞內(nèi)完成其復(fù)制和包裝等過(guò)程，該過(guò)程涉及多種蛋白，波形蛋白為其中一種。2006年Kim等用North-Western blot方法從Marc-145細(xì)胞中檢測(cè)到與PRRSV 3′非翻譯區(qū)RNA結(jié)合的分子量為57 ku的蛋白[13]，并驗(yàn)證該蛋白為波形蛋白。盡管波形蛋白在進(jìn)化過(guò)程中是保守的，但在不同細(xì)胞內(nèi)其執(zhí)行的功能不同，在多種病毒感染過(guò)程中都有著重要作用。王偉偉等[14]研究證明PRRSV易感細(xì)胞系Marc-145來(lái)源的猴波形蛋白及其抗體能阻斷PRRSV感染Marc-145細(xì)胞。目前已知豬是PRRSV唯一自然宿主，而豬腎細(xì)胞系PK-15細(xì)胞卻是PRRSV的非易感細(xì)胞。為了進(jìn)一步研究豬波形蛋白和猴波形蛋白的功能關(guān)系及其與PRRSV的關(guān)系，本研究從豬腎細(xì)胞系PK-15中擴(kuò)增出波形蛋白基因，表達(dá)純化后制備抗體，檢測(cè)豬波形蛋白及其抗體對(duì)PRRSV感染Marc-145細(xì)胞的影響，為PRRSV致病機(jī)制及其受體阻斷抑制劑的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒、細(xì)胞與菌株

PRRSV分離株TA-12（GenBank登陸號(hào)：HQ416720）、PK-15細(xì)胞、pET-28a （+）表達(dá)載體、受體菌E.coli Top10、表達(dá)菌BL21（DE3）均由本實(shí)驗(yàn)室保存，載體pMD18-T購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 主要試劑

TRIZOL購(gòu)自Invitrogen公司，HiFi ploymerase、dNTP、Ni-NTA Resin、DNA純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，T4連接酶、限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ購(gòu)自TaKaRa公司，異丙基-β-D-硫化半乳糖苷 （IPTG） 購(gòu)自Promega公司，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購(gòu)自Jackson公司，His 單克隆抗體購(gòu)自南京金斯瑞公司，抗PRRSV N蛋白單克隆抗體6D10由本實(shí)驗(yàn)室制備保存。

1.3 目的基因的擴(kuò)增和序列的測(cè)定

根據(jù)GenBank上公布的牛波形蛋白序列（序列號(hào)NM_173969.3），設(shè)計(jì)并合成一對(duì)引物，上游引物5′-CAGCCATGTCCACCAGG-3′，下游引物5′-GCTGGTAGTATTTTGCTGC-3′。提取PK-15細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；94℃ 1 min，55℃ 45 s，72℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后連接于pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞Top10中，提取質(zhì)粒，酶切、PCR鑒定后送上海生工測(cè)序。

1.4 重組質(zhì)粒PK-28a-VIM的構(gòu)建與鑒定

根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物，上游引物5′-ATAGGATCCATGTCCACCAGGACCGT -3′（帶有BamHⅠ識(shí)別位點(diǎn)），下游引物5′-CGCAAGCTTTTATTCCAGATCATCGTG -3′（帶有Hind Ⅲ識(shí)別位點(diǎn)）。以pMD18-T-VIM為模板進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；94℃ 1 min，55℃ 45 s，72℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)； 72℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化。將PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pET-28a相同酶切后回收，連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞Top10 中，提取質(zhì)粒，用酶切和測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒。1.5 重組表達(dá)質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)

將PK-28a-VIM質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21（Rosetta）感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落于濃度為100 μg/ml卡那霉素的LB 培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h。將菌液和培養(yǎng)基以1∶ 100 接種于濃度為100 μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃ 振蕩培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.4～0.6時(shí)，加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG，分別于誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后2、4、6 h收集菌液，12%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

1.6 重組蛋白的純化

大量表達(dá)后收集細(xì)菌，PBS洗滌菌體3次后超聲菌體，5 000×g 離心10 min，用8 mol/L尿素溶解。12 000×g 離心30 min，收集上清，按Ni柱說(shuō)明書(shū)純化蛋白。

1.7 Western blot 鑒定

將純化的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 后，轉(zhuǎn)到PVDF（聚偏氟乙烯）膜上，2.5%脫脂乳4℃封閉過(guò)夜，加入1∶ 4 000稀釋的抗His標(biāo)簽鼠單克隆抗體室溫孵育1 h， PBST洗滌3次，每次5 min，加入1∶ 4 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗，室溫孵育1 h， PBST洗滌3次，DAB（增敏二氨基聯(lián)苯胺）顯色。

1.8 抗波形蛋白抗體的制備

選取3只成年健康的雌性新西蘭大白兔，1 mg/只對(duì)兔子背部皮下及足底注射免疫，首次免疫后第14天和第28天分別進(jìn)行第2、3次免疫。首次免疫用弗氏完全佐劑，其余用弗氏不完全佐劑。每次免疫前對(duì)兔子進(jìn)行耳緣靜脈取血備用。

1.9 抗波形蛋白抗體檢測(cè)

將4 μg/ml的波形蛋白100 μl包被于ELISA孔板中，將三免收集的兔血清倍比稀釋?zhuān)肊LISA方法檢測(cè)抗體滴度。同時(shí)進(jìn)行IFA（免疫熒光）檢測(cè)，將抗重組波形蛋白血清按1∶ 40、1∶ 80、1∶ 160、1∶ 320稀釋加入到單層PK-15細(xì)胞上，每孔加入100 μl，37℃孵育1 h。加入TRITC（四鉀基異硫氰酸羅丹明）標(biāo)記的羊抗兔二抗，37℃避光孵育1 h后鏡檢，用未免疫的兔血清作為陰性對(duì)照。

1.10 波形蛋白的病毒阻斷檢測(cè)

純化后的豬波形蛋白用尿素濃度梯度為8～2 mol/L、pH梯度為6.0～8.5的復(fù)性溶液于16℃條件下進(jìn)行雙梯度透析復(fù)性，每個(gè)梯度透析12 h。將透析后含有2 mol/L尿素的5、10、50 μg波形蛋白分別與100 TCID50的PRRSV TA-12于37℃孵育1 h后，接種長(zhǎng)成單層的Marc-145細(xì)胞，37℃感作1 h后棄上清，PBS洗滌3次；加入含有3%新生牛血清的DMEM，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；用-20℃預(yù)冷的75%乙醇4℃固定30 min；加入抗PRRSV N蛋白的單抗6D10，37℃孵育1 h后加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗，37℃孵育1 h后熒光顯微鏡下觀(guān)察。禽戊肝病毒ORF-3蛋白作為陰性對(duì)照。重復(fù)3次。

1.11 抗波形蛋白抗體的病毒阻斷檢測(cè)

將抗豬波形蛋白抗體按1∶ 10、1∶ 20、1∶ 40和1∶ 80稀釋后分別加到長(zhǎng)成單層的Marc-145細(xì)胞上，37℃孵育1 h；棄上清，PBS洗滌3次，加入100 TCID50的PRRSV TA-12，感作1 h后加入含有3%新生牛血清的DMEM，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；拿出一塊細(xì)胞培養(yǎng)板用-20℃預(yù)冷的75%乙醇4℃固定30 min；加入抗PRRSV N蛋白的單抗6D10，37℃孵育1 h 后用PBS洗滌3次，每次5 min；再加入FITC（異硫氰酸熒光素）標(biāo)記的羊抗鼠二抗，37℃孵育1 h，熒光顯微鏡下觀(guān)察。以未免疫的兔血清作為陰性對(duì)照。另一塊培養(yǎng)7天，觀(guān)察CPE（細(xì)胞病變效應(yīng)）。重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)大小約為1 401 bp的特異性擴(kuò)增片段，與預(yù)期大小相符。序列測(cè)定結(jié)果表明其與GenBank公布的非全長(zhǎng)的野豬波形蛋白核苷酸序列同源性為99.1%，與牛波形蛋白核苷酸序列同源性為94.7%。

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定

重組載體PK-28a-VIM用BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定，結(jié)果切出與目的片段大小一致的片段，序列測(cè)定結(jié)果完全正確。

2.3 重組質(zhì)粒的表達(dá)及純化結(jié)果

對(duì)使用IPTG誘導(dǎo)前后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE 分析，結(jié)果表明，重組菌在誘導(dǎo)后出現(xiàn)大小約為57 ku的蛋白條帶，大小與預(yù)期的蛋白分子質(zhì)量基本一致，誘導(dǎo)后6 h蛋白的表達(dá)量最高。將重組菌超聲破碎后進(jìn)行SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)重組蛋白存在于菌體沉淀中，以包涵體形式存在。用8 mol/L尿素洗滌、溶解細(xì)胞沉淀，用Ni柱純化，得到了純度較高的目的蛋白（見(jiàn)圖3） 。

2.4 Western blot 鑒定結(jié)果

用鼠抗His標(biāo)簽單抗對(duì)純化的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果顯示重組波形蛋白在大小約57 ku處出現(xiàn)特異性反應(yīng)條帶2.5 抗波形蛋白抗體水平檢測(cè)結(jié)果

用ELISA方法檢測(cè)制備的抗波形蛋白抗體，血清按照1∶ 105 稀釋時(shí)，其OD值仍達(dá)到0.518，P/N值>2.1。使用制備2.6 波形蛋白的病毒阻斷IFA檢測(cè)

將不同量的波形蛋白與100 TCID50的PRRSV TA-12孵育后接種長(zhǎng)成單層的Marc-145細(xì)胞，IFA檢測(cè)結(jié)果顯示，Marc-145細(xì)胞的細(xì)胞病變與對(duì)照組相比明顯降低，波形蛋白的量越大阻斷效果越明顯，但是不能完全阻斷。

2.7 抗波形蛋白抗體的病毒阻斷IFA及CPE檢測(cè)

用抗波形蛋白抗體對(duì)100個(gè)TCID50的PRRSV TA-12株進(jìn)行病毒阻斷實(shí)驗(yàn)，IFA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)抗重組波形蛋白的陽(yáng)性血清按照1∶ 10稀釋時(shí)未檢測(cè)到陽(yáng)性細(xì)胞，而血清稀釋度在1∶ 20時(shí)陽(yáng)性細(xì)胞較陰性血清顯著減少，血清稀釋度在1∶ 40

橋粒相連，將細(xì)胞核和細(xì)胞器維持在特定的空間。它可以被多種蛋白激酶磷酸化，不同細(xì)胞表達(dá)的波形蛋白存在較大差異，可能與翻譯后的加工修飾有關(guān)。Kim等[13]對(duì)介導(dǎo)感染Marc-145細(xì)胞的受體進(jìn)行了研究，證明了波形蛋白能夠與PRRSV結(jié)合，外源表達(dá)的重組波形蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)到PRRSV非易感細(xì)胞系BHK-21和CRFK中，使PRRSV非易感細(xì)胞獲得了易感性，從而表明波形蛋白是PRRSV 受體復(fù)合物的一部分。

本實(shí)驗(yàn)從PK-15細(xì)胞中擴(kuò)增出豬波形蛋白，經(jīng)序列測(cè)定分析發(fā)現(xiàn)豬波形蛋白核苷酸序列與牛的同源性為94.7%，與人波形蛋白核苷酸序列的同源性為92.6%，與猴波形蛋白核苷酸序列的同源性為92.4%，與小家鼠波形蛋白核苷酸序列的同源性為90.4%。另外，本實(shí)驗(yàn)采用的原核表達(dá)載體為pET-28a（+），帶有His Tag 的蛋白標(biāo)簽，可與目的基因融合表達(dá)。經(jīng)誘導(dǎo)高效表達(dá)出大小約為57 ku的蛋白條帶。通過(guò)Western blot鑒定，所表達(dá)的融合蛋白可與His單抗發(fā)生特異性結(jié)合，由此說(shuō)明在大腸桿菌中成功表達(dá)了重組波形蛋白。透析后的重組波形蛋白與PRRSV孵育后感染Marc-145細(xì)胞，感染量明顯降低。利用純化的波形蛋白免疫兔子得到抗波形蛋白的多抗可阻斷PRRSV感染。有意思的是，PK-15是PRRSV的非易感細(xì)胞系，而抗PK-15細(xì)胞的波形蛋白的血清可以阻斷PRRSV感染，說(shuō)明不同的細(xì)胞表達(dá)了相似的波形蛋白，PRRSV易感與非易感細(xì)胞之間波形蛋白主要差異可能與翻譯后的加工修飾有關(guān)，其磷酸化可能與PRRSV對(duì)細(xì)胞的嚴(yán)格噬性有關(guān)。作為PRRSV非易感的PK-15細(xì)胞卻表達(dá)了能與PRRSV結(jié)合的波形蛋白，這對(duì)研究波形蛋白的結(jié)構(gòu)、功能以及在PRRSV入侵細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮的作用很有意義。同時(shí)，抗血清對(duì)PRRSV侵染細(xì)胞的阻斷作用為PRRS防控提供了一個(gè)新的切入途徑。

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