雙合湯含藥血清促進(jìn)BMSCs體外增殖的研究

段璋，周李學(xué)，李新建，李志敏，齊振熙

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)骨傷學(xué)院，福建福州350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建福州350122）

·實(shí)驗(yàn)研究·

雙合湯含藥血清促進(jìn)BMSCs體外增殖的研究

段璋1，周李學(xué)1，李新建1，李志敏1，齊振熙2

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)骨傷學(xué)院，福建福州350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建福州350122）

目的觀察雙合湯含藥血清對(duì)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）體外增殖的影響。方法采用全骨髓貼壁方法提取BMSCs，顯微鏡觀察形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)其表面標(biāo)記物，計(jì)數(shù)法繪制其生長(zhǎng)曲線，分別用低劑量、中劑量、高劑量10%雙合湯含藥血清代替胎牛血清（FBS）進(jìn)行藥物干預(yù)。結(jié)果培養(yǎng)的細(xì)胞以梭形為主，呈漩渦狀生長(zhǎng)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD34陽(yáng)性率為0.96%，CD90陽(yáng)性率為93.51%；生長(zhǎng)曲線似倒S型；給藥組的BMSCs增值速度比空白對(duì)照組均快，其中高劑量組增值速度最快。結(jié)論雙合湯含藥血清能促進(jìn)BMSCs體外的增值速度，且高劑量雙合湯含藥血清促進(jìn)BMSCs的增值速度最為明顯。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；全骨髓貼壁法；脂質(zhì)代謝紊亂；激素；骨壞死；骨質(zhì)疏松

干細(xì)胞是一類原始未分化，具有自我復(fù)制更新、高度和多方向分化的功能細(xì)胞［1］，它又分為胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESCs）和成體干細(xì)胞（adult stem cells，ASCs）。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）是ASCs的一種，是除造血干細(xì)胞以外的非造血干細(xì)胞［2］，主要存在于骨髓中，約占骨髓單核細(xì)胞0.001%～0.01%［3］。因其取材方便，體外增值能力強(qiáng)，具有向軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等細(xì)胞分化能力［4-5］，為骨、脂肪等組織損傷的恢復(fù)提供細(xì)胞來(lái)源，又易轉(zhuǎn)染、表達(dá)外源基因，在細(xì)胞、基因治療中有著廣泛的應(yīng)用前景［6］，因此BMSCs的有效擴(kuò)增顯得意義重大。此次實(shí)驗(yàn)以SD大鼠為研究動(dòng)物，采取全骨髓貼壁方法提取BMSCs，觀察雙合湯含藥血清對(duì)BMSCs增值速度的影響。

1 材料

1.1 動(dòng)物制備含藥血清：2月齡SPF級(jí)健康SD大鼠16只，雄性，體重（200±10）g，分為低劑量組、中劑量組、高劑量組、無(wú)含藥組，每組4只。分離提取BMSCs：3周齡SPF級(jí)健康SD大鼠2只，雄性，體重（110±15）g。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均來(lái)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK（瀘）2012-0002。

1.2 藥物采用《中醫(yī)內(nèi)科學(xué)》［7］治療痰瘀痹阻型痹癥的雙合湯：白芥子、姜半夏、陳皮、茯苓（去皮）、當(dāng)歸、川芎、白芍、生地黃各3 g，甘草、紅花各0.9 g，桃仁（去皮）2.4 g，生姜3片。由北京康仁堂藥業(yè)有限公司提供顆粒劑，用生理鹽水自制成濃度為1 g·mL-1的制劑，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑磷酸鹽緩沖液（PBS，美國(guó)Hyclone公司，批號(hào)：NAA1322）；低糖培養(yǎng)基（L-DMEM，美國(guó)Hyclone公司，批號(hào)：NAC1349）；0.25%胰酶（含0.02% EDTA，美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)：1686946）；胎牛血清（FBS，美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)：1715752）；mouse lgG1（美國(guó)Biolegend公司，批號(hào)：B184124）；CCK-8（碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：08010315 08）；CD34（美國(guó)Santa Cruz公司，批號(hào)：#J1014）；CD90（美國(guó)Biolegend公司，批號(hào)：B200112）；Goat anti-mouse lgG（美國(guó)Biolegend公司，批號(hào)：B180747）；10%水合氯醛溶液（北京雷根生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：0529A15）。

1.4 主要儀器流式細(xì)胞儀（美國(guó)Becton Dickinson公司，型號(hào)：BD FACSCaliburTM Flow Cytometer）；顯微鏡（德國(guó)Leica公司，型號(hào)：DMIL）；潔凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，型號(hào)：SW-CJ-1FD）；低速臺(tái)式離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，型號(hào)：TDZ4A-WS）；CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)SHEL-LAB公司，型號(hào)：3111）；Countstar自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（上海睿鈺生物科技有限公司，型號(hào)：IC 1000）。

2 方法

2.1 雙合湯含藥血清的制備根據(jù)人體與動(dòng)物藥物等效劑量換算，按人體重60 kg，SD大鼠體重0.2 kg計(jì)算，3片生姜稱得約3 g，再根據(jù)體表面積法計(jì)算：

等效給藥劑量/g＝人體的劑量/（g·kg-1）×60 kg×S大鼠·S人-1≈0.62 g。

低劑量為3.1 g·kg-1，中劑量為6.2 g·kg-1，高劑量為12.4 g·kg-1。分別用低、中、高劑量雙合湯溶液灌胃，并設(shè)為低、中、高劑量組。另設(shè)無(wú)含藥組，用生理鹽水1 mL/100 g灌胃，每天2次，連續(xù)7 d。在最后一次灌胃1 h后，用10%水合氯醛3～4 mL·kg-1腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈采血，離心（3 000 r·min-1，15 min），吸出血清放入15 mL離心管中，置56℃恒溫水浴箱30 min（滅活處理），再過(guò)濾（0.22 μL過(guò)濾器）除菌，-80℃保存待用。

2.2 SD大鼠BMSCs分離、傳代培養(yǎng)及形態(tài)觀察采用全骨髓貼壁法。取健康SPF級(jí)SD大鼠2只，用頸椎脫臼法處死大鼠，將大鼠浸入75%的酒精中5 min，然后將其移置紫外線消毒好的操作臺(tái)中；取大鼠雙側(cè)股骨和脛骨并用手術(shù)刀刮除其表面的肌肉和骨膜，再放入PBS緩沖液中漂洗干凈；用手術(shù)剪剪斷兩側(cè)干垢端，用5 mL一次性注射器抽取5 mL含10%FBS的L-DMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，使沖洗液流至60 mm培養(yǎng)皿中，沖到骨髓腔發(fā)白；用移液槍緩慢吹打沖洗液數(shù)次并接種到2個(gè)25 cm2塑料培養(yǎng)瓶中，置入95%空氣、5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；第1天后半量換液（吸走2.5 mL培養(yǎng)液，再加2.5 mL新的完全培養(yǎng)液），3 d后全量換液（盡量將沒(méi)貼壁細(xì)胞洗干凈）；以后每3 d換液一次，直至長(zhǎng)到80%左右（約10 d），進(jìn)行傳代；去培養(yǎng)液，PBS緩沖液洗2遍后每瓶加入1 mL預(yù)熱的0.25%的胰蛋白酶（含0.02%EDTA），室溫靜止消化；顯微鏡下見細(xì)胞變圓，少量細(xì)胞浮起時(shí)，立刻加入3 mL完全培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打瓶底，收集易消化的細(xì)胞懸液，離心（1 000 r·min-1，離心5 min）；倒掉上清液，加入完全培養(yǎng)基重懸，按1∶2接種到25 cm2塑料培養(yǎng)瓶中，每瓶接種4～6 mL，從培養(yǎng)到傳代過(guò)程都在倒置顯微鏡拍照，觀察細(xì)胞形態(tài)。

2.3 SD大鼠BMSCs的流式表型鑒定取生長(zhǎng)良好的第3代BMSCs，待生長(zhǎng)至90%融合時(shí)，用預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗2遍，消化離心（1 000 r·min-1，5 min），棄清液，用預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞1次；再離心，棄上清；用含0.1%BSA的PBS將細(xì)胞濃度調(diào)整為3×106mL-1，將細(xì)胞分裝至1.5 mL的EP管中，每管100 μL；再按量于各個(gè)樣品管內(nèi)加入相對(duì)應(yīng)異硫氰酸熒光素標(biāo)記（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）的一抗CD34、CD90，每組并設(shè)陰性對(duì)照組和同型對(duì)照組；陰性對(duì)照組不加任何抗體，同型對(duì)照組加FITC-mouse lgG1；小心吹打混勻，避光，室溫靜止30 min；往每樣品管內(nèi)添加適量1.5 mL PBS，吹打數(shù)次混勻，離心（1 000 r·min-1，5 min），棄上清；PBS重懸洗滌1次，棄上清；往各樣品管內(nèi)分別加入100 μL PBS，按量（參照抗體說(shuō)明書）往各樣品管內(nèi)分別加入對(duì)應(yīng)的二抗FITC Goat anti-mouse lgG，吹打混勻；避光，室溫靜止30 min，往每樣品管內(nèi)添加適量1.5 mL PBS，小心吹打混勻；離心（1 000 r·min-1，5 min），吸去上清液；最后往每管中加入300 μL PBS重懸細(xì)胞，裝入檢測(cè)管，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMSCs細(xì)胞表面標(biāo)志性抗原CD34、CD90陽(yáng)性率鑒定大鼠BMSCs。

2.4 SD大鼠BMSCs生長(zhǎng)曲線測(cè)定選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代BMSCs細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，每孔1 mL，接種密度為1×1010mL-1，培養(yǎng)24 h后每日取3孔細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，連續(xù)檢測(cè)7 d（間隔時(shí)間24 h，允許誤差5%）。7 d后用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀自動(dòng)繪制生長(zhǎng)曲線。

2.5 不同藥物濃度對(duì)SD大鼠BMSCs體外增殖活性分析選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代BMSCs細(xì)胞，胰酶消化，重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，以2×103mL-1密度100 μL均勻接種于3塊96孔板培養(yǎng)，且設(shè)加無(wú)含藥血清的孔作為空白對(duì)照組，每組接種6個(gè)孔，進(jìn)行培養(yǎng)（在37℃，5%CO2的條件下）6 h；向培養(yǎng)板中分別加入低、中、高劑量的雙合湯含藥血清與無(wú)含藥血清的培養(yǎng)基各10 μL刺激；將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱分別孵育24、48、72 h；每孔加入10 μL或用培養(yǎng)基稀釋1倍至20 μL CCK-8溶液（注意不要在孔中生成氣泡，會(huì)影響OD值的讀數(shù)，外圍一排孔加相應(yīng)量PBS，并把培養(yǎng)板放在靠近培養(yǎng)箱水源的地方），在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育3 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度，如無(wú)450 nm濾光片，可以使用420～480 nm的濾光片，作為參考波長(zhǎng)進(jìn)行雙波長(zhǎng)測(cè)定。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料屬于正態(tài)分布的用單因素方差分析，非正態(tài)分布的用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用卡方檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 BMSCs生長(zhǎng)形態(tài)骨髓液剛接種于培養(yǎng)瓶時(shí)，懸浮著大小不一、圓型、折光性強(qiáng)的細(xì)胞于培養(yǎng)液中，如圖1。24 h換液后可見部分貼壁細(xì)胞，呈單個(gè)散在或多個(gè)聚在一起的短梭形、多角形或星形細(xì)胞，如圖2。9～10 d融合80%～90%，細(xì)胞呈典型的放射狀排列、同心圓狀集落生長(zhǎng)，如圖3。消化傳代后，細(xì)胞24 h后完全貼壁，生長(zhǎng)旺盛，2～3 d即可傳代，如圖4。繼續(xù)培養(yǎng)仍能保持細(xì)胞形態(tài)及增值能力，至少能傳10代。

3.2 流式細(xì)胞儀鑒定SD大鼠BMSCs表面標(biāo)記物流式檢測(cè)結(jié)果顯示細(xì)胞均一性較好，表面抗原CD34陽(yáng)性表達(dá)率為0.96%，見圖5。CD90陽(yáng)性表達(dá)率為93.51%，見圖6。同型對(duì)照組的mouse lgG1陽(yáng)性表達(dá)率均為1.17%。說(shuō)明培養(yǎng)的SD大鼠細(xì)胞為BMSCs且純度較高。

3.3 SD大鼠BMSCs生長(zhǎng)曲線經(jīng)過(guò)24 h的貼壁后，從圖7可見，其生長(zhǎng)似倒S型，前4 d為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，增值速度加快，第5 d開始進(jìn)入平臺(tái)期，增值速度減慢。

3.4 雙合湯含藥血清對(duì)BMSCs體外增殖活性的影響由表1可知，通過(guò)24 h、48 h、72 h的干預(yù)觀察發(fā)現(xiàn)雙合湯能促進(jìn)BMSCs的增值且高劑量組促進(jìn)BMSCs的增值最為明顯。

4 討論

分離獲取BMSCs目前有多種方法可選［8-9］：全骨髓貼壁法操作過(guò)程簡(jiǎn)單，培養(yǎng)初期一定程度上保留了體內(nèi)其生長(zhǎng)環(huán)境，得到的細(xì)胞分化潛能較好，但細(xì)胞成分較復(fù)雜，均一性較差并且破碎的紅細(xì)胞碎片可能對(duì)BMSCs生長(zhǎng)有一定影響；密度梯度離心法操作過(guò)程較復(fù)雜，易引起細(xì)胞污染，但分離的細(xì)胞純度較高；流式細(xì)胞儀分選法和免疫磁珠分選法過(guò)程復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)條件要求高，骨髓量需求大，價(jià)格昂貴，對(duì)細(xì)胞損傷大，再加上未發(fā)現(xiàn)特異性很強(qiáng)的表面標(biāo)記物，因此其應(yīng)用受到限制［10］。林楚偉等［11］實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)全骨髓貼壁培養(yǎng)法比密度梯度離心法所分離得到的細(xì)胞，其活力、增殖能力有明顯提高，更適合下面的實(shí)驗(yàn)。本研究采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離純化的SD大鼠BMSCs呈長(zhǎng)梭形、集落樣、漩渦狀生長(zhǎng)，均勻地表達(dá)BMSCs表面標(biāo)記抗原CD90，而不表達(dá)造血前體細(xì)胞標(biāo)記抗原CD34，符合BMSCs的生物學(xué)特性，可以用于BMSCs相關(guān)研究。

表1 不同濃度雙合湯含藥血清對(duì)BMSCs體外增殖活性的影響

表1 不同濃度雙合湯含藥血清對(duì)BMSCs體外增殖活性的影響

注：與空白對(duì)照組比較，1）P＜0.01；與高劑量組比較，2）P＜0.05。

組別空白對(duì)照組低劑量組中劑量組高劑量組n 6 6 6 6 OD值24 h 0.3147±0.002 0.3310±0.0041）2）0.3430±0.0031）2）0.3645±0.0031）48 h 0.3717±0.004 0.3860±0.0041）2）0.3918±0.0021）2）0.4077±0.0071）72 h 0.6122±0.004 0.6423±0.0031）2）0.6650±0.0031）2）0.6952±0.0031）

BMSCs具有多種表面標(biāo)志分子，如間充質(zhì)、成纖維細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的表面標(biāo)志分子，目前還無(wú)獨(dú)有的標(biāo)志分子，如表達(dá)表面抗原CD90、CD166及黏附分子CD44（HCAM）、CD54（ICAM-1），不表達(dá)CD34、CD45等造血干/祖細(xì)胞的標(biāo)志物［12-13］。

雙合湯是治療痰瘀痹阻型痹癥的經(jīng)典方，臨床療效肯定。近年來(lái)，有關(guān)雙合湯對(duì)BMSCs增值的影響尚未見報(bào)道。目前，影響B(tài)MSCs體外增殖的資料顯示［10］：10%的FBS有助于其穩(wěn)定生長(zhǎng)，高濃度或低濃度的FBS均不利于其生長(zhǎng)，低濃度FBS營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不夠，高濃度FBS含有大量促進(jìn)其分化的因子，加快細(xì)胞老化；傳代密度按1∶2接種到25 cm2的塑料培養(yǎng)瓶比較合適，這可能和細(xì)胞間的相互接觸抑制有關(guān)；細(xì)胞因子對(duì)BMSCs的促增殖影響，如堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）等。本實(shí)驗(yàn)選擇10% FBS培養(yǎng)基，1∶2比例傳到第3代進(jìn)行體外擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明雙合湯含藥血清能促進(jìn)BMSCs的增長(zhǎng)，這可能和化痰活血藥物對(duì)細(xì)胞因子的作用有關(guān)。

QuanCui等［14］認(rèn)為長(zhǎng)期使用激素會(huì)使脂肪細(xì)胞肥大及造血細(xì)胞變少，促進(jìn)BMSCs向脂肪細(xì)胞分化，激素誘導(dǎo)的骨母細(xì)胞向脂肪細(xì)胞形成和脂質(zhì)代謝紊亂在激素性骨壞死和骨質(zhì)疏松中起主要作用。脂質(zhì)代謝紊亂即高脂血癥，中醫(yī)學(xué)又稱為“痰濁”。Boss等［15］又認(rèn)為高脂血癥會(huì)引起骨內(nèi)微血管中出現(xiàn)脂肪栓子、血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生損害、血流障礙、血管內(nèi)凝血系統(tǒng)紊亂，中醫(yī)學(xué)里又稱之為“血瘀”證。采用雙合湯即為臨床解決BMSCs增值數(shù)量又可以針對(duì)“痰瘀”的癥狀治療。對(duì)于本方治療長(zhǎng)期應(yīng)用激素導(dǎo)致BMSCs成脂分化即脂質(zhì)代謝紊亂的骨壞死和骨質(zhì)疏松，其作用機(jī)制以及中藥藥理作用有待于深入研究，這為我們中藥治療激素性骨壞死和骨質(zhì)疏松的新藥研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

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R285.5

：A

：1000-338X（2016）06-0036-04

2016-09-10

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81473705）

段璋（1988—），男，碩士研究生，研究方向：股骨頭壞死的基礎(chǔ)與臨床研究。

齊振熙（1957—），男，博士，教授。E-mail：zxqi@fjtcm.edu.cn