土沉香組織培養(yǎng)外植體消毒方法的研究

汪騰越，周再知，裘珍飛，梁坤南，曾炳山，馬華明，黃桂華

土沉香組織培養(yǎng)外植體消毒方法的研究

汪騰越，周再知，裘珍飛，梁坤南，曾炳山，馬華明，黃桂華

(中國林業(yè)科學(xué)研究院 熱帶林業(yè)研究所，廣東 廣州 510520)

針對在土沉香Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg組織培養(yǎng)過程中外植體的有效消毒方式問題，以1年生土沉香實(shí)生苗為材料，開展了莖段外植體次氯酸鈉(5%、10%、20%)和升汞(0.05%、0.1%、0.2%)3個(gè)濃度水平的消毒試驗(yàn)；在此基礎(chǔ)上，開展了外植體(葉片、頂芽和莖段)，次氯酸鈉消毒時(shí)間(0，3，5 min)和升汞消毒時(shí)間(0，3，5 min)的3因素3水平正交L9(34) 組合排列試驗(yàn)。結(jié)果表明：莖段外植體采用10%濃度的次氯酸鈉、0.1%濃度的升汞消毒，效果較好；莖段較葉片、頂芽的污染率和死亡率低，存活率高，為適宜的外植體。最佳消毒方式為75%的酒精浸泡30 s，0.1%升汞消毒5 min，該方法污染率最低、存活率最高，分別為43.33%、31.67%。

土沉香；組織培養(yǎng)；外植體；消毒方法

土沉香Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg，又稱土沉香、莞香、女兒香，是瑞香科Thymelaeaceae沉香屬Aquilaria多年生常綠闊葉樹種，分布于海南、廣東、廣西、云南、福建、臺(tái)灣等地[1]。土沉香是我國特有、珍貴的藥用植物，莖桿經(jīng)刀砍、蟲蛀、病腐、真菌感染后，形成的樹脂為沉香。沉香是傳統(tǒng)名貴藥材和天然香料，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、止痛和抑制結(jié)核桿菌生長等多種功效[2]，經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高，特別是上等沉香。土沉香樹形美觀、樹姿優(yōu)雅、枝繁葉茂、四季常綠，也是觀賞價(jià)值頗高的園林綠化樹種[3]。

近年來由于人們對沉香的無度索取，致使土沉香天然林遭到嚴(yán)重破壞，加之天然林更新能力弱，國內(nèi)土沉香野生資源已近枯竭，現(xiàn)僅有零星散生分布，資源現(xiàn)狀令人堪憂。土沉香已被列入“國家珍稀瀕危三級(jí)保護(hù)植物”與“國家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物”名錄[4]。采用組織培養(yǎng)繁殖技術(shù)，可以在一定程度上保留母本的優(yōu)良性狀，增加良種的繁育能力和數(shù)量。組培技術(shù)已經(jīng)成為保護(hù)和繁殖珍貴樹種的有效措施之一[5]。從野外采集的外植體一般表面和內(nèi)部都攜帶著一定數(shù)量的細(xì)菌和真菌，為組織培養(yǎng)過程中的主要污染源。有效的消毒方法是組織培養(yǎng)成功的前提和保障。不同樹種、部位(器官)以及幼嫩程度的外植體，其有效的消毒方法各不相同。目前，對一些珍稀瀕危樹種外植體消毒方法的探討與研究[6-8]逐漸增多，而對土沉香盡管開展了組織培養(yǎng)技術(shù)[2,9-12]的研究，但尚未見有關(guān)土沉香外植體消毒的專門研究報(bào)道。本文針對土沉香不同外植體，開展了次氯酸鈉與升汞濃度兩種消毒劑消毒濃度、消毒時(shí)間試驗(yàn)，旨在篩選出適宜的外植體消毒方法，為土沉香組織培養(yǎng)提供無菌操作保障，為土沉香的無性繁殖提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

材料取自中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所土沉香資源保存圃。在圃中選取生長旺盛、健壯、無病蟲害的1年生土沉香苗木，取當(dāng)年萌生葉片、頂芽和莖段。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和方法

1.2.1 外植體的處理

將采下的外植體用洗衣粉水來清洗外植體10 min，流水沖洗30 min。在超凈工作臺(tái)上，用75%的酒精浸泡外植體30 s，無菌水涮洗1次，然后按照試驗(yàn)要求對外植體進(jìn)行不同消毒劑、不同時(shí)間的浸泡消毒，之后用無菌水涮洗3次。把消毒好的外植體置于鋪有無菌濾紙的盤中，吸干材料表面的水分。若外植體是葉片，則切掉四周與藥液接觸的部分，再切成1.0 cm2左右的小塊；若外植體是頂芽，則切掉末端與藥液接觸的部分，再切成3.0 cm左右的小段；若外植體是莖段，則切掉兩端與藥液接觸的部分，再切成2.0 cm左右的小段。接種到MS + 6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L的誘導(dǎo)培養(yǎng)基(添加7.5 g/L瓊脂、30 g/L蔗糖)，pH值5.8～6.0[9-11]。培養(yǎng)室溫度(25±1)℃，光強(qiáng)度3 000 lx，光照時(shí)間12 h/d[12]。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

消毒劑次氯酸鈉與升汞濃度篩選：分別設(shè)計(jì)3個(gè)處理(次氯酸鈉濃度：5%、10%、20%，升汞濃度：0.05%、0.1%、0.2%)，每個(gè)處理60瓶，每瓶接種1個(gè)外植體，試驗(yàn)重復(fù)3次，。以當(dāng)年生的莖段枝條為外植體，每個(gè)外植體消毒5 min。30 d之后，統(tǒng)計(jì)污染率、死亡率和存活率，篩選出消毒劑次氯酸鈉與升汞的適宜消毒濃度。

1.2.3 正交試驗(yàn)

采用3因素、3水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。3因素分別為外植體、10%次氯酸鈉浸泡消毒時(shí)間和0.1%升汞浸泡消毒時(shí)間。試驗(yàn)共設(shè)9個(gè)處理，按照L9(34)設(shè)計(jì)排列(表1)，每個(gè)處理60瓶，每瓶接種1個(gè)外植體，試驗(yàn)重復(fù)3次。30 d之后，統(tǒng)計(jì)污染率、死亡率和存活率，篩選出外植體消毒的最佳消毒方式。

表1 土沉香外植體消毒L9 (34) 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Design of orthogonal test L9(34) for disinfection method of explants of Aquilaria sinensis

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Microsoft Excel統(tǒng)計(jì)污染率、死亡率、存活率及其反正弦變換(公式y(tǒng) = s in)。利用SAS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析，Duncan法進(jìn)行多重比較。

二是高校財(cái)務(wù)制度在執(zhí)行過程中，會(huì)不斷產(chǎn)生各種新的執(zhí)行政策和要求，且許多財(cái)務(wù)事項(xiàng)均需相關(guān)部門協(xié)同進(jìn)行簽批。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 次氯酸鈉適宜濃度

方差分析結(jié)果表明，在污染率、死亡率和存活率指標(biāo)上，不同次氯酸鈉濃度處理之間差異極顯著(P<0.001)。5%次氯酸鈉濃度處理的污染率最高（表2），達(dá)88.33%，隨濃度的上升污染率顯著下降，但10%與20%濃度處理之間差異不顯著（圖1）。當(dāng)次氯酸鈉的濃度提高到20%時(shí)，污染率雖然得到一定程度的控制，但死亡率卻明顯上升，從5%次氯酸鈉濃度處理的3.33%升至20%濃度處理的11.67%。在存活率指標(biāo)上，10%次氯酸鈉濃度處理的顯著的高于其他兩個(gè)處理，分別比5%和20%次氯酸鈉濃度處理提高了13.34% 和5.00 %?？梢?，10%次氯酸鈉濃度為適宜的消毒濃度。

表2 不同濃度的次氯酸鈉消毒效果Table 2 Disinfection effects of different concentrations of NaClO

圖1 不同濃度次氯酸鈉的消毒效果Fig.1 Disinfection effects of different concentrations of NaClO

2.1.2 升汞適宜濃度

在污染率、死亡率和存活率指標(biāo)上，不同升汞濃度處理之間差異均達(dá)到極顯著水平(P<0.001)。0.2%升汞濃度處理的死亡率最高，為46.67%（表3），隨著濃度的下降死亡率顯著下降，但是0.05%與0.1%濃度處理之間差異不顯著。圖2顯示，當(dāng)升汞的濃度降低到0.05%時(shí)，死亡率雖然得到一定程度的控制，但是污染率卻明顯上升，從0.05%升汞鈉濃度處理的33.33%升至0.2%濃度處理的65.00%。0.1%升汞濃度處理的存活率顯著高于其他兩個(gè)處理，分別比0.05%和0.2%升汞濃度處理提高了20.00%和11.67%。由此可見，0.1%升汞濃度為適宜的消毒濃度。

表3 不同濃度的升汞消毒效果Table 3 Disinfection effects of different concentrations of HgCl2

圖2 不同濃度升汞的消毒效果Fig.2 Disinfection effects of different concentrations of HgCl2

2.2 正交試驗(yàn)

2.2.1 外植體的消毒效果

不同外植體的污染率和死亡率差異極顯著(P<0.001)。葉片的污染率最高（表4），達(dá)到72.78%，而莖段的最低，為55.74%，頂芽介于兩者之間，但頂芽的死亡率最高，達(dá)到36.30%，顯著的高于葉片和莖段處理。在存活率指標(biāo)上，莖段處理顯著高于其他兩個(gè)處理，分別比葉片和頂芽處理提高了22.78%和21.85%?？梢姡o段較葉片和頂芽消毒效果好。

表4 不同外植體的消毒效果Table 4 Comparison of disinfection effects of different types of explants

2.2.2 次氯酸鈉不同消毒時(shí)間的消毒效果

表5 次氯酸鈉不同消毒時(shí)間消毒效果比較Table 5 Comparison of disinfection effects of different NaClO disinfection time

2.2.3 升汞不同消毒時(shí)間的消毒效果

在污染率、死亡率和存活率3個(gè)指標(biāo)上，不同升汞消毒時(shí)間處理之間差異均達(dá)到極顯著水平（P<0.001）。不采用升汞鈉消毒的污染率最高（表6），達(dá)到87.04%，隨著消毒時(shí)間的延長，污染率顯著下降。升汞消毒5 min處理的污染率最低，為47.59%, 但死亡率亦達(dá)到最高。盡管不使用升汞處理的死亡率低，但污染率也高。從存活率指標(biāo)上看，不使用升汞顯著的低于升汞消毒(3 min或5 min)處理?？梢姡鳛橥庵搀w消毒的主要消毒劑是必不可少的。

表6 升汞不同消毒時(shí)間的消毒效果比較Table 6 Comparison of disinfection effects of different HgCl2 disinfection time

2.2.4 不同處理之間的消毒效果

9個(gè)處理之間的污染率、死亡率和存活率差異極顯著（P<0.001）。由多重比較（表7）可知，處理1(A1B1C1)的污染率達(dá)100.00%，顯著高于其它處理，處理7(A3B3C3)最低，為42.22%。處理的3(A1B3C3)和處理5(A2B2C3)的死亡率較高，消毒時(shí)間過長導(dǎo)致外植體死亡，盡管處理1(A1B1C1)的死亡率低，但都已被污染，失去了培養(yǎng)意義。在存活率指標(biāo)上，處理7(A3B1C3)最高、其次為處理9(A3B3C2)，顯著的高于其它幾個(gè)處理。綜上所述，處理7的存活率高，污染率與死亡率低，為土沉香外植體消毒的最佳消毒處理，即以土沉香莖段為外植體采用0.1%升汞消毒5 min。

3 結(jié)論與討論

3.1 外植體

木本植物組織培養(yǎng)過程中，如不能有效的降低各環(huán)節(jié)的污染率，必將直接影響無菌體系的建立，也就意味著組培工藝難以延續(xù)。在自然條件下，作為外植體的植物材料，無論外部還是內(nèi)部都帶有很多的細(xì)菌和霉菌。為了給外植體提供一個(gè)無菌的生長環(huán)境，消毒就成為了在植物組織培養(yǎng)過程中一個(gè)不可或缺的步驟[13]。選取外植體并對其進(jìn)行有效的消毒，亦是組織培養(yǎng)首要解決的問題。本試驗(yàn)所選用的3種外植體(葉片、頂芽、莖段枝條)中，莖段的污染率和死亡率較葉片和頂芽的低，而存活率較葉片和頂芽的高。莖段的消毒效果最佳，其次是頂芽，葉片最差。

表7 正交試驗(yàn)9個(gè)處理消毒效果的多重比較Table 7 Duncan’s multiple range test of 9 treatments in an orthogonal test

土沉香葉片外植體的污染率和死亡率均較高，存活率低，消毒效果差，或許與消毒試劑接觸面較大有關(guān)。頂芽是植物最幼嫩的器官組織，所攜帶的微生物量比其它器官組織相對少，但因其過于幼嫩，又極易被殺死，無法實(shí)現(xiàn)同時(shí)降低污染率與死亡率的目的。以同一植株的不同器官為外植體，消毒結(jié)果不同，還可能與不同部位的外植體其表達(dá)基因不同，或是產(chǎn)生不同的生長物質(zhì)和次生物質(zhì)，或是帶菌情況不同有關(guān)[14]?？傊?，原因較復(fù)雜，尚需進(jìn)一步研究探索。

3.2 消毒劑與消毒時(shí)間

不同的植物，在自然條件下生長，所攜帶的菌也有所不同，所采取的消毒方式也各不相同。因此，消毒方式(即消毒劑的種類、濃度和消毒時(shí)間)的選擇對于植物組織培養(yǎng)的成敗起著至關(guān)重要的作用。研究結(jié)果表明，土沉香外植體最佳消毒處理為A3B1C3組合，該組合的污染率最低，為43.33%，存活率最高，為31.67%。最優(yōu)消毒方式為：采用土沉香莖段為外植體，用洗衣粉水清洗外植體10 min，流水沖洗30 min。在超凈工作臺(tái)中，用75%的酒精浸泡30 s，無菌水涮洗1次，0.1%升汞消毒5 min，無菌水涮洗3次。

本試驗(yàn)采用了10%次氯酸鈉與0.1%升汞作為消毒劑。兩者比較而言，0.1%升汞具有較好的滅菌作用，這可能是因?yàn)镠g2+可以與帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合，使細(xì)菌蛋白變性、酶失活所致[15]。在土沉香外植體消毒時(shí)間長短上，最重要的問題就是如何處理污染率、死亡率、存活率之間的關(guān)系。當(dāng)采取相對較長的消毒時(shí)間時(shí)，可以有效的降低試驗(yàn)材料的污染率，但是外植體被消毒劑損傷，產(chǎn)生次生代謝物，毒害細(xì)胞，導(dǎo)致死亡率又隨之顯著上升；為了降低死亡率，采取了相對較短的消毒時(shí)間，隨之而來的結(jié)果是外植體會(huì)因消毒不徹底而導(dǎo)致污染率顯著上升。因此，選擇一個(gè)相對適宜的消毒時(shí)間成為了土沉香外植體消毒試驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。

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Disinfection methods of explants of Aquilaria sinensis in tissue culture

WANG Teng-yue, ZHOU Zai-zhi, QIU Zhen-fei, LIANG Kun-nan, ZENG Bing-shan, MA Hua-ming, HUANG Gui-hua
(Research Institute of Tropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Guangzhou 510520, Guangdong, China)

Focused on the issues of explants’ effective disinfection schemes in the tissue culture of Aquilaria sinensis, one-year-old seedings of Aquilaria sinensis in the nursery were used as propagation material.Using stem explants, two disinfection experiments with three concentrations of NaClO (5%, 10% and 20%) and HgCl2(0.05%, 0.1% and 0.2%) were carried out.Based on the result,an orthogonal experiment with L9(34) array of three factors and three levels, namely explants (leaf, terminal bud and stem), NaClO’s disinfection time (0, 3, 5 min) and HgCl2’s disinfection time (0, 3, 5 min), was conducted.The results show the optimal concentration of NaClO and HgCl2was 10% NaClO and 0.1% HgCl2respectively.Compared with the explants of leaf and terminal bud, stem explants were much better for disinfection in view of its lower rate of contamination and mortality and relatively higher survive rate.The optimal disinfection schemes was that the stem explants were immersed in alcohol (75%) for 30 seconds, and then were immersed in HgCl2(0.1%) for 5 minutes with the lowest contamination rate (43.33%) and the highest survive rate (31.67%).

Aquilaria sinensis；tissue culture；explants；disinfection methods

S727.3

A

1673-923X(2012)03-0044-05

2011-11-19

國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)“熱帶珍貴樹種良種選育和高效培育技術(shù)研究”（201204301）

汪騰越(1988—)，女，四川成都人，碩士研究生，主要從事珍貴樹種培育研究；E-mail：wangtengyue@yahoo.cn

周再知(1963—)，女，研究員，博士，主要從事熱帶珍貴樹種繁育技術(shù)研究；E-mail：zzzhoucn@gmail.com

[本文編校：吳 毅]