百事樂膠囊對慢性應(yīng)激抑郁模型小鼠血清IL-1β和TNF-α的影響

郭 純，蔡光先*，劉柏炎，易 健，藺曉源

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院省部共建中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部重點實驗室，湖南 長沙 410007）

百事樂膠囊對慢性應(yīng)激抑郁模型小鼠血清IL-1β和TNF-α的影響

郭 純，蔡光先*，劉柏炎，易 健，藺曉源

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院省部共建中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部重點實驗室，湖南 長沙 410007）

目的 探討百事樂膠囊對慢性應(yīng)激抑郁小鼠行為學(xué)及血清白細(xì)胞介素1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）含量的影響。方法 60只雄性昆明種小鼠隨機分為正常組、模型組、百事樂膠囊高、中、低劑量組和氟西汀組。除正常組外，其他組給予21 d慢性不可預(yù)見性應(yīng)激造模。每天造模前各組小鼠分別予以相應(yīng)藥物灌胃治療，模型組以等量蒸餾水灌胃。測定小鼠體質(zhì)量，通過敞箱實驗和懸尾不動實驗檢測小鼠行為學(xué)變化，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定小鼠血清IL-1β和TNF-α的含量。結(jié)果 模型組小鼠發(fā)生明顯的行為學(xué)改變，水平和垂直活動明顯減少，懸尾不動時間明顯延長；百事樂膠囊高、中、低劑量組能顯著增加小鼠體質(zhì)量（P<0.05），改善小鼠的行為學(xué)指標(biāo)（P<0.01），百事樂膠囊高、中劑量能降低血清IL-1β和TNF-α水平，與模型組比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與氟西汀組相比，百事樂膠囊高、中、低劑量組各指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 百事樂膠囊能顯著改善慢性應(yīng)激抑郁小鼠的行為學(xué)變化，其作用可能與下調(diào)慢性應(yīng)激所致的血清IL-1β和TNF-α水平有關(guān)。

百事樂膠囊；慢性應(yīng)激抑郁模型；小鼠；白細(xì)胞介素1β；腫瘤壞死因子α

隨著社會競爭的加劇，諸多應(yīng)激因素的增加，抑郁癥的發(fā)病率呈上升趨勢[1]。應(yīng)激和心理應(yīng)激能激活免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致細(xì)胞因子的產(chǎn)生。細(xì)胞因子是一類能在細(xì)胞間傳遞信息、具有免疫調(diào)節(jié)和效應(yīng)功能的蛋白質(zhì)或小分子多肽。外周與中樞自身產(chǎn)生的細(xì)胞因子影響著中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能，包括神經(jīng)遞質(zhì)代謝、神經(jīng)內(nèi)分泌功能、神經(jīng)可塑性等，可導(dǎo)致抑郁性行為[2]。百事樂膠囊具有明顯的抗抑郁作用，李東雅[3]臨床研究顯示，其在改善臨床癥狀和HAMD量表積分方面效果優(yōu)于氟西汀，為了進一步研究其作用機制，本研究旨在探討中藥復(fù)方百事樂膠囊對慢性心理應(yīng)激抑郁小鼠的行為學(xué)及血清細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）含量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 昆明種雄性小鼠60只，體質(zhì)量18～22 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK（湘）2009-0004。實驗過程中動物可以自由攝食和飲水（禁食和禁水應(yīng)激除外），室溫20～25℃，相對濕度60%～70%。

1.1.2 藥物 百事樂膠囊（專利號CN101816766A）：由湖南省中醫(yī)藥研究院制備，由姜黃、人參等組成，批號 ：20110322，0.38 g/粒 ，9 粒/d， 相當(dāng)于生藥15 g/d。鹽酸氟西汀膠囊，由常州華生制藥有限公司生產(chǎn)，批號：80710001，20mg/粒，20mg/d。

1.1.3 試劑 小鼠IL-1β酶聯(lián)免疫吸附 (ELISA)試劑盒和小鼠TNF-α ELISA試劑盒購自美國RD公司（批號：201105）；水合氯醛，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，用生理鹽水配制成10%濃度。

1.1.4 儀器 MK3酶標(biāo)儀（芬蘭Labsystems）；YLS-9A生理藥理電刺激儀（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站）；SB5200超聲波清洗儀（上海必能信超聲公司）；HH.W21.Cu 600恒溫水浴箱（上海醫(yī)療器械七廠）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與造模 （1）昆明種小鼠60只，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機分為6組：空白組、模型組、氟西汀組、百事樂低、中、高劑量組，每組10只。（2）正常組正常飲水?dāng)z食，不給任何刺激。其余各組接受為期21 d的不可預(yù)知的應(yīng)激刺激，刺激方法根據(jù)文獻[4]改進，包括：12 h禁食，12 h禁水，通宵照明，夾尾（1min），4 ℃冷水游泳 5min，超聲刺激（110 dB，1 h），足底電擊 5min(1 mA，30 V，每隔1min刺激1次，每次持續(xù)30 s，共5次)。每天隨機給予一種刺激，使小鼠不能預(yù)料刺激的發(fā)生，以避免產(chǎn)生適應(yīng)。

1.2.2 給藥方法 灌胃藥量按60 kg成人體表面積換算成30 g小鼠用量。造模前1 h，模型組小鼠灌胃蒸餾水，氟西汀組小鼠灌胃鹽酸氟西汀藥液2.6mg/（kg·d），百事樂膠囊低、中、高劑量組小鼠灌胃百事樂膠囊藥液 （按生藥量分別為0.95、1.90、3.80 g/（kg·d）。 灌胃量為 0.2 mL/10 g體質(zhì)量，每天灌胃給藥后給予1種刺激，持續(xù)21 d。

1.2.3 體質(zhì)量測定 所有小鼠于實驗第1、7、14、21天用電子動物秤稱體質(zhì)量并記錄測定結(jié)果。體質(zhì)量增加（g）=實驗后測定體質(zhì)量（g）－實驗前體質(zhì)量（g）。

1.2.4 行為學(xué)測定 所有小鼠于造模第21天進行行為學(xué)觀察。（1）敞箱試驗：用不透明材料自制敞箱裝置，底面為50 cm×50 cm的正方形，被白線等分為25個等邊方格(10 cm×10 cm)，周邊高30 cm。8:00～12:00之間在安靜的房間內(nèi)進行觀察。將小鼠置于中心方格內(nèi)，適應(yīng)1min后，觀察小鼠5min內(nèi)的水平活動次數(shù)（指穿越格數(shù)，四爪均進入的方格方可記數(shù)）和垂直活動次數(shù)（指前肢直立次數(shù)，兩前爪騰空或攀附墻壁）。（2）懸尾實驗：將小鼠尾端2 cm的部位固定，使其呈倒掛狀態(tài)，其頭部離地面5～6 cm，用木板隔開相鄰動物的視線，適應(yīng)1min后，記錄每只小鼠5min內(nèi)的累計不動時間。

1.2.5 血清IL-1β和TNF-α含量檢測 各組小鼠以10%水合氯醛（4.0 mL/kg）麻醉后，打開胸腔，直接從心臟內(nèi)抽血靜置后，3000 r/min離心，小心吸取血清，于-30℃保存。小鼠血清IL-1β和TNF-α的含量采用ELISA法檢測，步驟嚴(yán)格按照試劑盒的操作說明進行。各個步驟完成后，用酶標(biāo)儀于450 nm波長處測定OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品（由試劑盒提供）的測定數(shù)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品中IL-1β和TNF-α含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 百事樂膠囊對慢性應(yīng)激小鼠體質(zhì)量變化的影響

各組小鼠體質(zhì)量在造模后第7、14、21天均有增加。模型組小鼠體質(zhì)量增加顯著低于正常組 （P<0.01）；百事樂低、中、高劑量組和氟西汀組小鼠的體質(zhì)量增加均高于模型組（P<0.05），但仍低于正常組（P<0.05或P<0.01）。百事樂低、中、高劑量組和氟西汀組相比，無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 各組小鼠體質(zhì)量變化的比較 （，n=10）

表1 各組小鼠體質(zhì)量變化的比較 （，n=10）

注：與正常組比較 *P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較 #P＜0.05。

組 別正常組模型組氟西汀組百事樂低劑量組百事樂中劑量組百事樂高劑量組藥物劑量（g/kg）— —0.00260.951.903.807 d 4.90±0.412.46±0.32**3.27±0.67*#3.01±0.71*#3.07±0.56*#3.12±0.64*#14 d 8.36±0.613.59±0.52**5.39±0.79**#5.23±0.63**#5.19±0.69**#5.33±0.80**#21 d 10.44±0.704.50±0.53**6.86±1.01**#6.76±0.79**#6.74±0.58**#6.81±0.92**#體質(zhì)量增加（g）

2.2 百事樂膠囊對慢性應(yīng)激小鼠行為學(xué)的影響

造模21 d后，模型組小鼠的水平活動次數(shù)和垂直活動次數(shù)均低于正常組，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），模型組的懸尾不動時間與正常組比較顯著延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。各治療組小鼠的水平活動次數(shù)、垂直活動次數(shù)和懸尾不動時間相比均有明顯改善，與模型組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。百事樂低、中、高劑量組與氟西汀組相比無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

2.3 百事樂膠囊對慢性應(yīng)激小鼠血清IL-1β和TNF-α含量的影響

模型組小鼠血清IL-1β和TNF-α水平均高于正常組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。百事樂中、高劑量組和氟西汀組小鼠血清的IL-1β水平均低于模型組（P<0.01），與正常組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。百事樂低、中、高劑量組和氟西汀組小鼠血清的TNF-α水平也顯著低于模型組（P<0.05或P<0.01），與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。百事樂低、中、高劑量組小鼠血清IL-1β和TNF-α水平與氟西汀組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

表2 各組小鼠水平和垂直活動次數(shù)及懸尾不動時間的比較 （，n=10）

表2 各組小鼠水平和垂直活動次數(shù)及懸尾不動時間的比較 （，n=10）

注：與正常組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較#P＜0.05，##P＜0.01。

組 別正常組模型組氟西汀組百事樂低劑量組百事樂中劑量組百事樂高劑量組水平活動次數(shù)143.43±6.0483.10±6.53**137.12±6.98##114.21±6.10##126.14±7.37##131.50±7.21##垂直活動次數(shù)48.15±4.2734.14±3.28*46.15±3.65#42.72±3.95#44.57±3.64#45.85±4.01#懸尾不動（s）62.00±6.20103.00±9.85**66.29±7.54##73.03±9.01##69.23±8.17##68.91±8.39##

表3 各組小鼠血清IL-1β和TNF-α含量的比較 （，n=10，ng/L）

表3 各組小鼠血清IL-1β和TNF-α含量的比較 （，n=10，ng/L）

注：與正常組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較#P＜0.05，##P＜0.01。

組 別正常組模型組氟西汀組百事樂低劑量組百事樂中劑量組百事樂高劑量組IL-1β 9.12±0.3210.75±0.51*8.50±0.39##9.94±0.419.03±0.26##8.81±0.47##TNF-α 27.26±1.9733.24±1.96*25.96±1.23#26.72±2.16#25.69±2.93#24.51±1.37##藥物劑量（g/kg）— —0.00260.951.903.80

3 討論

抑郁癥屬中醫(yī)學(xué)“郁證”范疇，病始在肝，及于心神。因情而郁，氣血失調(diào)是其病機關(guān)鍵。郁證之初以氣滯為主，繼發(fā)血瘀，瘀結(jié)于內(nèi)，不得宣泄，上犯清竅，則神明失用。情志不暢，氣郁日久，氣血交阻，血流不暢，瘀血停積，則心神不寧。百事樂膠囊是本課題組研發(fā)的抗抑郁中藥復(fù)方新制劑，由姜黃、人參等組成，具有理氣活血，寧心安神的作用。其組方中姜黃活血化瘀、行氣止痛，善破肝脾二經(jīng)之血瘀氣結(jié)；人參大補元氣、安神益智。

慢性心理應(yīng)激抑郁模型是基于抑郁癥的環(huán)境誘因以及快感缺失的核心癥狀而模擬。各項檢測指標(biāo)中，體質(zhì)量反映動物健康狀況，敝箱實驗反映動物在新環(huán)境中的探究行為和緊張狀況，懸尾實驗反映動物的絕望情緒及抑郁狀態(tài)。本實驗結(jié)果顯示，應(yīng)激后小鼠體質(zhì)量增長、敝箱試驗活動水平以及懸尾不動時間均出現(xiàn)異常，說明本實驗慢性心理應(yīng)激動物模型制作成功。百事樂膠囊高、中、低劑量均能有效改善慢性應(yīng)激對小鼠體質(zhì)量的影響，提高抑郁模型小鼠的自主活動和探究能力，減少抑郁模型小鼠懸尾不動時間，說明百事樂膠囊能有效改善抑郁模型小鼠的體質(zhì)量和行為學(xué)變化。

抑郁癥的發(fā)生常伴一定程度的炎癥反應(yīng)激活，促炎性細(xì)胞因子升高已成為抑郁癥的標(biāo)志性現(xiàn)象。臨床上觀察到很多應(yīng)用細(xì)胞因子免疫治療的患者表現(xiàn)出一系列抑郁樣癥狀，并且抗抑郁藥能夠阻斷這些癥狀[5]。IL-1β和TNF-α屬于前炎癥細(xì)胞因子，是一系列炎癥反應(yīng)中最早產(chǎn)生的細(xì)胞因子。研究表明，心理性應(yīng)激反應(yīng)能使腦內(nèi)情感調(diào)節(jié)區(qū)的IL-1β和TNF-α等促炎癥性細(xì)胞因子濃度增加[6]。臨床研究顯示抑郁癥患者治療前血清IL-1β和TNF-α顯著高于對照組，經(jīng)藥物治療后顯著下降[7-8]。動物實驗研究表明抑郁模型大鼠血清IL-1β和TNF-α含量顯著升高，而藥物可使其水平下調(diào)[9-10]。本研究中百事樂膠囊中、高劑量組小鼠血清IL-1β和TNF-α水平均顯著低于模型組，說明百事樂膠囊具有下調(diào)抑郁模型小鼠血清IL-1β和TNF-α的作用。

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Effects of Baishile Capsule on serum IL-1β and TNF-α in mice with chronic stress model of depression

GUO Chun,CAI Guang-xian*,LIU Bai-yan,YI Jian,LIN Xiao-yuan
（First Affiliated Hospital,TCM University of Hunan,Changsha,Hunan 410007,China）

Baishile Capsule;chronic stress of depression;mouse;IL-1β;TNF-α

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2012.11.006.024.03

〔Absrract〕Objective To investgate the effects of Baishile Capsules(BSL)on the behaviors and blood serum IL-1β and TNF-α in mice with chronic stress model of depression.Methods 60 male mice were randomlydivided intohealthycontrolgroup (HCG),modelgroup(MOG),BSL high dose group(HDG),medium dose group(MDG),low dose group(LDG)and fluoxetine group(FTG).Except HCG,others were exposed to chronic stress with 21 days for model.All the animals in treated group were respectively given corresponding medicine before modeling.MOG were given the same volume of distilled water.Body weights of mice were measured,behavioral changes were tested by Open-field experimentand the immobility time in tailsuspension experiment.The contents of IL-1β and TNF-α of mice were tested by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.Results Obvious behavioral changes were found in MOG，including the reduce of horizontal and vertical activities and the prolong of tail suspension immobility time.Compared with MOG,the body weights of mice were significantly increased （P<0.05） and the behavioral parameters were improved remakably（P<0.01） in HDG,MDG and LDG.The mice serum levels of IL-1β and TNF-α in HDG and MDG were obviously decreased （P<0.05）.Compared with FTG,these indicators of HDG,MDG and LDG had no significant differences（P＞0.05）.Conclution Baishile Capsule can significantly improve the behavior changes of chronic stress mice.Its effect may be related to the downward levels of serum IL-1β and TNF-α.

2012－06－20

國家自然科學(xué)基金項目（81202693）；湖南省教育廳科學(xué)研究項目（12C0276）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)校級青年基金項目（2011）。

郭 純（1979-），女，湖南醴陵人，講師，博士研究生，主要從事抑郁癥的中醫(yī)藥防治研究。

* 蔡光先，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：lby1203@sina.com。

（本文編輯 彭芝配）