六味地黃湯對5/6腎切除大鼠腎組織中細胞外基質(zhì)的影響

唐 群 ，何澤云*，徐文峰 ，陳 麗 ，徐 琴 ，曾海飛 ，張爽爽

（1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

六味地黃湯對5/6腎切除大鼠腎組織中細胞外基質(zhì)的影響

唐 群1，何澤云2*，徐文峰1，陳 麗1，徐 琴1，曾海飛1，張爽爽1

（1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

目的 觀察六味地黃湯對慢性腎衰大鼠腎組織細胞外基質(zhì)的影響，探討其防治腎間質(zhì)纖維化的可能機制。方法 用5/6腎切除大鼠復(fù)制慢性腎衰模型，分空白對照組、假手術(shù)組、模型組和六味地黃湯組。術(shù)后8周，檢測各組腎功能指標；HE染色觀察腎臟組織病理變化，Masson染色檢測腎臟中膠原纖維沉積；免疫組化法檢測ColⅠ、ColⅢ、FN在腎組織中的表達；Western blot法檢測PDGF-A、PDGF-B在腎組織中的蛋白表達水平。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組24 h尿蛋白、血尿素氮和血肌酐明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，六味地黃湯組24 h尿蛋白（P＜0.01）、血尿素氮（P＜0.01）和血肌酐（P＜0.05）均明顯降低。模型組HE和Masson染色顯示大鼠腎間質(zhì)纖維化明顯，大量膠原纖維沉積，六味地黃湯組腎間質(zhì)纖維化程度明顯減輕，少量膠原纖維沉積。免疫組化法顯示，與假手術(shù)組比較，模型組腎組織中ColⅠ、ColⅢ、FN蛋白水平均明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，六味地黃湯組腎組織中ColⅠ、ColⅢ、FN蛋白水平均明顯降低（P＜0.05）。Western blot法顯示，與假手術(shù)組比較，模型組腎組織中PDGF-A、PDGF-B蛋白水平均明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，六味地黃湯組腎組織中PDGF-A、PDGF-B蛋白水平均明顯降低（P＜0.01）。結(jié)論 六味地黃湯可能通過下調(diào)PDGF-A、PDGF-B表達，從而減少腎組織中細胞外基質(zhì)的積聚而抑制腎間質(zhì)纖維化。

腎間質(zhì)纖維化；5/6腎切除；細胞外基質(zhì)；大鼠；六味地黃湯；熟地黃；山藥；山茱萸

六味地黃湯是臨床上治療腎陰虛證型慢性腎小球腎炎的有效方劑[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，腎間質(zhì)纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）是各種原因?qū)е碌倪M行性腎臟疾病最重要的病理特點，細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的沉積是腎間質(zhì)纖維化的主要病變基礎(chǔ)。 I型膠原（Collagen type I，Col I）、Ⅲ型膠原（Collagen typeⅢ，ColⅢ）及纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）是ECM的主要成分。血小板源性生長因子-A（PDGF-A）和血小板源性生長因子-B（PDGF-B）是經(jīng)典的血小板源性生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF） 存在形式[2]。PDGF可促進ECM合成增多、降解減少，因此與腎間質(zhì)纖維化關(guān)系密切[3-5]。本研究采用5/6腎切除制作慢性腎功能衰竭大鼠模型，觀察六味地黃湯對5/6腎切除大鼠腎組織中ECM的影響，探討六味地黃湯防治腎間質(zhì)纖維化的作用機制?，F(xiàn)將實驗方法及結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量（200±10）g，由湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供并飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學SPF級動物房。動物合格證號：SCXK（湘）2009-0001。

1.1.2 藥物 六味地黃湯（熟地黃24 g，山藥12 g，山茱萸 12 g，澤瀉 9 g，茯苓 9 g，牡丹皮 9 g）購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥劑科。先將藥材用相當于藥材5倍質(zhì)量的自來水浸泡2 h煮沸后再微火煎熬30min，過濾后收集煎液，原藥渣加少量水再煎煮1次，濾過。將2次煎液合并，于水浴恒溫器上濃縮至每毫升藥液含生藥1 g。

1.1.3 試劑 一抗為兔抗大鼠 ColⅠ、ColⅢ、FN、PDGF-A、PDGF-B 多克隆抗體（美國 Santa Cruz），兔二步法免疫組化檢測試劑盒（PV-6001）；二抗為生物素標記山羊抗兔IgG（北京中杉金橋）；DAB顯色試劑盒（武漢博士德）；ECL化學發(fā)光試劑（美國Pierce）。

1.1.4 儀器 SHANDON FINESSE325型石蠟切片機（英國珊頓公司）；Motic BA410T生物顯微鏡（德國）；顯微形態(tài)分析系統(tǒng) （北京麥克奧迪）；MultiphorII Nova Blot（瑪西亞生物技術(shù)）；PROTEAN II Xi Cell（美國 BIO-RAD）；垂直電泳槽（美國 Hoefer公司）；微量加樣器（北京吉爾森公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物造模 SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機分為空白對照組、假手術(shù)組、模型組、六味地黃湯組4組，每組10只。模型組、六味地黃湯組均在無菌條件下進行5/6腎切除術(shù)，以10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠，常規(guī)消毒鋪巾，從左腹部切口，打開腹腔，靜脈夾夾住腎蒂后切除左腎上下極（切除2/3），以明膠海綿壓迫止血，復(fù)位腎臟。1周后進行第2次手術(shù)，切除右側(cè)腎臟。假手術(shù)組采取同樣步驟，打開腹腔暴露腎臟后避免牽拉腎臟，不切除腎臟。

1.2.2 給藥方法 造模后第2天，六味地黃湯組予以六味地黃湯浸膏灌胃，給藥劑量均按70 kg成人的體表面積換算，灌胃量為 3.2 g/（kg·d）?？瞻讓φ战M、假手術(shù)組和模型組以等容積蒸餾水灌胃，灌胃量為 10 mL/（kg·d）。每天 1 次，連續(xù) 8 周。各組大鼠灌胃中途死亡者予以剔除。

1.2.3 標本收集 各組大鼠分別于第8周后處死，處死前收集24 h尿量，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測24 h尿白蛋白（24 h UAlb）。腹主動脈采血分離血清，酶法測定血肌酐（Scr）濃度，尿素酶-GLDH法測定尿素氮（BUN）濃度。腎組織分為兩部分處理：（1）光鏡觀察。標本用4%多聚甲醛固定，分別進行HE染色、Masson染色及免疫組化檢測。（2）腎組織取出后立即放入液氮罐中，隨后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存待用。

1.2.4 腎臟組織學檢查 腎組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片（厚度為3～4μm）后，分別進行HE染色及Masson染色，Olympus顯微鏡觀察并拍照。

1.2.5 免疫組織化學法檢測 免疫組化采用兔二步法檢測試劑盒 （PV-6001），一抗用兔抗大鼠ColⅠ（1∶200）、Col Ⅲ（1∶200）、FN（1∶200）抗體，二抗用相應(yīng)羊抗兔抗體 （工作濃度按產(chǎn)品說明書配制為1∶100），染色呈棕褐色或棕黃色者為陽性染色。顯微鏡下觀察每張切片并隨機選取5個視野，用麥克奧迪數(shù)碼醫(yī)學分析系統(tǒng)（Motic Med 6.0）進行圖像分析。測定視野內(nèi)陽性細胞的平均灰度值，以灰度值進行定量分析，測得組織細胞平均灰度值愈小，其蛋白水平愈高。

1.2.6 Western blot法檢測 常規(guī)提取蛋白質(zhì)樣品，BCA法進行蛋白質(zhì)定量。每泳道50 μg蛋白，10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳分離后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉，分別加一抗PDGF-A（1∶300）、PDGF-B（1∶300），4 ℃孵育過夜，洗膜。加相應(yīng)二抗（1∶100）室溫孵育，ECL試劑X線底片上顯色。掃描測定條帶密度值，以與β-actin的比值作為表達強度。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行處理分析，計量資料用“”表示，多樣本均數(shù)間比較用單因素方差分析檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 六味地黃湯對5/6腎切除大鼠腎臟功能的影響

空白對照組與假手術(shù)組之間腎功能比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與假手術(shù)組比較，模型組24 h尿白蛋白、血尿素氮和血肌酐均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，六味地黃湯組24 h尿白蛋白（P＜0.01）、尿素氮（P＜0.01）和血肌酐（P＜0.05）均顯著降低。見表1。

表1 六味地黃湯對5/6切除大鼠腎臟功能的影響 （）

表1 六味地黃湯對5/6切除大鼠腎臟功能的影響 （）

注：與假手術(shù)組比較 **P＜0.01；與模型組比較△P＜0.05，△△P＜0.01。

組 別空白對照組假手術(shù)組模型組六味地黃湯組n 101079藥物劑量（g/kg）蒸餾水蒸餾水蒸餾水3.224 h UAlb（mg）4.43±0.803.60±1.4022.12±1.05**19.08±2.02**△△BUN（mmol/L）5.40±0.996.49±0.9813.54±1.33**11.66±1.20**△△SCr（μmol/L）56.30±5.0659.60±5.8287.42±6.92**77.44±5.68△

2.2 六味地黃湯對5/6腎切除大鼠腎組織形態(tài)學的影響

HE染色下，空白對照組及假手術(shù)組大鼠腎組織未見明顯病變，腎小球和腎小管大小、形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清晰，間質(zhì)未見明顯炎細胞浸潤。模型組腎皮質(zhì)變薄，腎小球系膜細胞明顯增生，硬化增多，部分腎小管明顯萎縮、消失，部分腎小球發(fā)生代償性肥大，腎小管發(fā)生代償性擴張，部分可見蛋白管型，間質(zhì)纖維組織增生，大量淋巴細胞浸潤。與模型組相比，六味地黃湯組病變程度明顯減輕，腎小球硬化減少，腎小管萎縮及間質(zhì)纖維化程度減輕，炎細胞浸潤減少（圖1）。Masson染色下，空白對照組及假手術(shù)組僅腎小球和腎小管基底膜染成藍色，腎間質(zhì)無明顯膠原纖維。模型組腎間質(zhì)見大量染成藍色的膠原纖維。六味地黃湯組腎間質(zhì)可見少量膠原纖維（圖2）。

2.3 六味地黃湯對5/6腎切除大鼠腎組織ColⅠ、ColⅢ和FN表達的影響

2.3.1 ColⅠ的表達 假手術(shù)組微表達，模型組和六味地黃湯組表達增加，尤以遠曲小管表達最明顯，腎小球及腎間質(zhì)相對較弱，六味地黃湯組較模型組表達減弱（圖 3）。

2.3.2 ColⅢ的表達 假手術(shù)組、六味地黃湯組和模型組均有表達且依次增強，主要在腎小管，尤其是遠曲小管最為明顯，腎小球和腎間質(zhì)表達相對較弱（圖 4）。

2.3.3 FN的表達 腎小球、腎小管及腎間質(zhì)中均有表達，其中以遠曲小管最為明顯，組間相比，以模型組最強，六味地黃湯組次之，假手術(shù)組最弱（圖 5）。

2.3.4 各組腎組織ColⅠ、ColⅢ、FN表達半定量分析 腎組織ColⅠ、ColⅢ、FN表達均以模型組最強，六味地黃湯組次之，假手術(shù)組最弱。與假手術(shù)組比較，模型組ColⅠ、ColⅢ、FN表達均明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，六味地黃湯組ColⅠ、ColⅢ、FN表達均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。 見表 2。

表2 3組腎組織ColⅠ、ColⅢ、FN表達免疫陽性部分半定量分析 （）

表2 3組腎組織ColⅠ、ColⅢ、FN表達免疫陽性部分半定量分析 （）

注：與假手術(shù)組比較**P＜0.01；與模型組比較△P＜0.05。

組 別假手術(shù)組模型組六味地黃湯組n 1079 ColⅠ230.5±24.5134.3±11.4**162.8±10.7△ColⅢ216.4±12.4132.2±17.2**174.0±16.3△FN 229.4±17.9148.4±21.4**182.8±15.7△

2.4 六味地黃湯對5/6腎切除大鼠腎組織PDGFA、PDGF-B蛋白水平的影響

與假手術(shù)組比較，模型組和六味地黃湯組PDGF-A、PDGF-B蛋白水平均明顯升高，且模型組與假手術(shù)組之間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；六味地黃湯組PDGF-A、PDGF-B蛋白水平明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見圖6～7。

3 討論

慢性腎臟病 （Chronic kidney disease，CKD）是一種嚴重危害人類健康的泌尿系統(tǒng)疾病，未來20年，CKD導(dǎo)致終末期腎臟疾病 （end-stage renal disease，ESRD）的發(fā)生率將顯著升高而成為一種流行病。腎間質(zhì)纖維化是各種CKD發(fā)展到ESRD的共同途徑，其主要病理改變表現(xiàn)為腎間質(zhì)成纖維細胞增生和ECM過度積聚，是多種細胞、生長因子、細胞因子共同參與、相互作用，最終導(dǎo)致ECM合成增多、降解減少，過度沉積的結(jié)果[6]。

5/6腎切除大鼠是目前研究慢性腎臟病進展的理想動物模型。本研究模型組大鼠腎組織形態(tài)學改變、24h尿白蛋白、血尿素氮和血肌酐檢測結(jié)果與慢性腎衰的表現(xiàn)基本一致，說明本實驗制作的慢性腎功能衰竭模型是成功的。ECM是由細胞產(chǎn)生并分泌到細胞外周圍中的物質(zhì)，主要包括纖維成分（如膠原和彈性蛋白）、連接蛋白（如纖維連接蛋白等）和填充分子（如糖胺聚糖）等。正常的情況下，ECM的生成和降解保持動態(tài)平衡。腎臟局部缺血、缺氧及炎癥細胞浸潤時，多種生長因子持續(xù)表達導(dǎo)致腎間質(zhì)成纖維細胞增生和ECM的沉積，其中PDGF與腎間質(zhì)纖維化關(guān)系密切，其主要機制是能夠促進肌纖維母細胞產(chǎn)生膠原[7]，尤其是I型及Ⅲ型膠原，并通過抑制膠原酶活性[8]，減少ECM 的降解，最終導(dǎo)致ECM合成增多、降解減少，過度沉積，形成纖維化。本研究發(fā)現(xiàn)模型組 PDGF-A、PDGF-B、ColⅠ、ColⅢ、FN蛋白水平均明顯高于假手術(shù)組，提示PDGF-A、PDGF-B可能通過促進ColⅠ、ColⅢ、FN的合成與分泌，從而導(dǎo)致ECM在腎間質(zhì)中過度沉積。

六味地黃湯始見于宋·錢乙的 《小兒藥證直訣·卷下諸方》，以張仲景《金匱要略》的腎氣丸減桂枝、附子，易干地黃為熟地黃而成，其臨床治療慢性腎臟病運用廣泛，且療效肯定，然其作用機制尚不完全明了。以往的研究已證實：5/6腎切除大鼠在手術(shù)后8周，留存腎不可避免地發(fā)生了間質(zhì)纖維化[9]；給5/6腎切除大鼠灌胃六味地黃湯8周后，其血清尿素氮、肌酐的水平明顯低于模型組，并能減少留存腎系膜細胞的增生及間質(zhì)纖維化，使腎切除大鼠生存期延長[10]。六味地黃湯具有改善5/6腎切除大鼠殘腎腎功能的作用，其改善殘腎腎功能的作用與六味地黃湯提高腎小球的體積密切相關(guān)[11]。在本研究中：與模型組比較，六味地黃湯組PDGF-A、PDGF-B、ColⅠ、ColⅢ、FN蛋白水平均明顯降低。說明六味地黃湯可能通過下調(diào)PDGF-A、PDGF-B表達，從而減少腎組織中ECM（如ColⅠ、ColⅢ和 FN）的沉積而抑制腎間質(zhì)纖維化。

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Effects of Liuwei Dihuang decotion on extracellular matrix of renal tissues in 5/6 nephrectomy rats

TANG Qun1,HE Ze-yun2,XU Wen-feng2,CHEN Li1,XU Qin2,ZENG Hai-fei2,ZHANG Shuang-shuang2
(1.TCM University of Hunan,Changsha，Hunan 410208,China;2.First Affiliated Hospital,TCM University of Hunan,Changsha，Hunan 410007,China)

renal interstitial fibrosis； 5/6 nephrectomy； extracellular matrix； rat； Liuwei Dihuang decotion； prepared Radix rehmanniae； Yam； Cornus

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2012.11.005.019.05

〔Absrract〕Objective To observe the influence of Liuwei Dihuang decotion on the extracellular matrix of renal tissue in rat model with chronic renal failure and study its mechanism of preventing renal interstitial fibrosis.Methods The rat model of chronic renal failure were induced by 5/6 nephrectomy,rats were divided into 4 groups as follows:blank control group,sham operation group,model group and Liuwei Dihuang decotion group.At 8 weeks after the operation,index of renalfunction wasdetected,the pathologicalchange ofrenaltissueswasobserved by HE stain,collagen deposition in renal was detected by Masson staini,the ColⅠ,Col Ⅲ,FN expression levels in renal tissues were examined by immunohistochemistry assay,the PDGF-A,PDGF-B proteinlevels in the renal tissues were examined by western blot assay.Results Compared with sham operation group,24h urinary protein,blood urea nitrogen and serum creatinine in model group were increased significantly(P<0.01).Compared with model group,24h urinary protein(P<0.01),blood urea nitrogen(P<0.01)and serum creatinine(P<0.05)in Liuwei Dihuang decotion group were decreased significantly.Renal interstitial fibrosis and collagen deposition were obvious in model group,and renal interstitial fibrosis and collagen fibers deposition were markedly reduced in Liuwei Dihuang decotion group.Compared with sham operation group,the ColⅠ,ColⅢ,FN protein levels of renal tissues in model group were significantly increased(P＜0.01).And these proteins expression levels in Liuwei Dihuang decotion group were significantly lower than those in model group(P<0.05)。Compared with sham operation group,the PDGF-A,PDGF-B protein levels of renal tissues in model group were significantly increased(P＜0.01).The expression levels of PDGF-A and PDGF-B proteins in Liuwei Dihuang decotion group were significantly lower than those in model group(P＜0.01).Conclusion Liuwei Dihuang decotion may reduce the accumulation of extracellular matrix of renal tissues and prevent renal interstitial fibrosis through down-regulating the expression of PDGF-A and PDGF-B.

2012－06－15

湖南省自然科學基金（重點）資助項目（09JJ3064）；湖南省高校創(chuàng)新平臺（09K057）。

唐 群（1980-），男，湖南東安人，講師，博士研究生，主要從事病理學教學、科研及中醫(yī)藥防治慢性腎臟病研究。

* 何澤云，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：hzywjl2003@yahoo.com.cn。

（本文編輯 彭芝配）