日本結(jié)縷草體細胞變異表型和分子標記的研究

劉 莉，包滿珠

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院 園藝植物生物學(xué)教育部重點實驗室，湖北 武漢430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)楚天學(xué)院，湖北 武漢430205）

日本結(jié)縷草（Zoysiajaponica）又稱為結(jié)縷草，禾本科虎尾草亞科結(jié)縷草屬，自然分布于亞洲東部環(huán)日本海、渤海、黃海及東海沿岸，廣泛分布于我國東部、朝鮮半島和日本列島溫暖地帶［1］。結(jié)縷草低矮、堅韌耐磨、耐踐踏、彈性好，具有發(fā)達的地下根莖，耐粗放管理，在園林、庭園和固土方面都有廣泛運用，是草坪植物中適應(yīng)性強的一個暖季型草種［2］。

我國結(jié)縷草種質(zhì)資源極為豐富，位居世界各國之首［1，3-5］。但結(jié)縷草的應(yīng)用處于較低水平，如掠青采種，品種單一，尤其自主產(chǎn)權(quán)新品種匱乏。因此，資源創(chuàng)新是利用結(jié)縷草資源的當務(wù)之急。傳統(tǒng)育種效率低下，具有較多困難，如有性雜交、花期不遇、小穗上的小花太小不便操作等［6］。因而，借助新型的分子生物學(xué)育種手段可有效地加快育種的步伐。

體細胞變異以其變異廣泛、遺傳復(fù)雜、可以保持品種的基本特性而成為獲得較多新種質(zhì)的一個捷徑，是新品種選育和生理研究的一種重要方法。狗牙根（Cynodondactylon）、結(jié)縷草和假儉草（Eremochloaophiuroides）通過體細胞變異育種已經(jīng)獲得一些新品系［7-13］。日本結(jié)縷草的組織培養(yǎng)研究已經(jīng)比較成熟，而且由種子誘導(dǎo)的愈傷可以長期繼代并獲得了較高的再生頻率［14-15］。結(jié)縷草自然分布區(qū)生態(tài)環(huán)境差異很大，是一種能適應(yīng)多種生境的廣生態(tài)幅植物［1］，利用分子標記檢測同樣發(fā)現(xiàn)變異較大［16］，具有容易發(fā)生遺傳變異的特性。因此，組織培養(yǎng)是獲得體細胞變異的一種良好方法。

變異的方向及遺傳穩(wěn)定性是變異能否可利用的關(guān)鍵。鑒定體細胞變異一個通用、便捷的方法是表型的變異結(jié)合分子標記遺傳穩(wěn)定性的雙重鑒定方法。日本結(jié)縷草的分子標記方法已經(jīng)發(fā)展很快，但由于ISSR標記法有較好的穩(wěn)定性及簡便性而成為本研究的首選方法。本研究以1粒日本結(jié)縷草種子誘導(dǎo)的愈傷繼代18個月后的再生植株為材料，在大田經(jīng)過小區(qū)種植，利用ISSR標記檢測再生單株的DNA序列多態(tài)性，以期探討結(jié)縷草愈傷長期繼代再生植株的變異特點，并運用于育種及其他研究中。

1 材料與方法

1.1 材料 從青島海源草坪有限公司購買的日本結(jié)縷草種子，通過組織培養(yǎng)［17］，誘導(dǎo)愈傷，其中1粒種子誘導(dǎo)出愈傷，經(jīng)增殖擴繁繼代18個月后再生得到植株，種植于花盆中。隨機選取20棵單株，種植于小區(qū)中，設(shè)定3個重復(fù)，每個小區(qū)0.5m×0.5m，統(tǒng)一管理，水肥一致。

1.2 方法

1.2.1 表型性狀觀測 草層高度：指自然高度，重復(fù)3次；葉片長度和寬度：隨機抽取直立莖的頂部向下第2片成熟葉片5片，測定其長度和寬度；匍匐莖葉片長度和寬度：隨機取5片匍匐莖頂端下第2、3節(jié)成熟葉片測定其長度和寬度；匍匐莖的長度和數(shù)量，匍匐莖在相同生長時間（一個生長季）的蔓延長度和數(shù)量；生殖枝高度：指從地表到總狀花穗基部的自然高度，重復(fù)5次；穗長度：指花序的基本長度，重復(fù)10次；綠色期：以播種的草坪為對照，50%葉片枯黃視為失去觀賞性［18］。

1.2.2 總DNA的提取 采用CTAB方法［19］，提取新鮮幼嫩葉片總DNA，用紫外分光光度計檢測DNA純度和濃度后置于-20℃下備用。

1.2.3 ISSR標記分析 ISSR體系和PCR程序經(jīng)反復(fù)試驗，選擇重復(fù)性好的反應(yīng)體系和程序：1×Buffer，2.0mmol·L-1Mg2＋，0.2mmol·L-1dNTP，1Utaq（Fermentas，深圳晶美生物工程公司購買），模板DNA 10ng，0.5μmol·L-1引物，加入重蒸水到20μL。PCR程序：94℃預(yù)變性4min，然后5個循環(huán)，退火溫度從60℃梯度降溫至56℃，一個循環(huán)降1℃，即94℃30s，60℃45s循環(huán)到94℃30s，56℃45s，72℃90s，后退火溫度在55℃時進行33個循環(huán)（個別30個循環(huán)）；最后72℃延伸10min，4℃保存［20］。反應(yīng)在BIO-RAD的PTC-100TMPCR儀上進行。

從實驗室已有的40條ISSR引物中篩選多態(tài)性好、重復(fù)性好的引物6條（表1）。

表1 文中ISSR引物信息Table 1 ISSR primers used in this study

1.3 數(shù)據(jù)處理方法 表型性狀于2005年生長季測定，表型性狀中數(shù)量性狀取測量平均值，并利用SPSS 13.0對20個樣品做主成分分析，并將這些數(shù)據(jù)標準化后用NTSYS軟件計算遺傳距離，利用UPGMA進行聚類分析。PCR擴增產(chǎn)物電泳后在凝膠上具有相同遷移率的位置上有DNA條帶的記為1，無DNA條帶的記為0。記錄的ISSR的表型數(shù)據(jù)矩陣利用NTSYS軟件以Nei’s遺傳距離做UPGMA聚類分析，并將表型數(shù)據(jù)與ISSR表型數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 主成分分析各指標之間的關(guān)系 通過主成分分析得到各主成分特征值的大小，前5個主成分累計所占的比例為88.40%，可以代表整體（表2）。特征向量分析顯示各主成分權(quán)重沒有占較大優(yōu)勢，前5個主成分權(quán)重比較平均。第1主成分與直立莖草層高度、直立莖葉片長度和直立莖葉片寬度具有較高相關(guān)性，代表直立莖的表型；第2主成分主要表型指標依次是匍匐莖的總長度、生殖枝高度和匍匐莖數(shù)量，主要是匍匐莖的蔓延能力和生殖枝高度；第3主成分的主要指標為穗長及匍匐莖葉片長寬度；第4主成分主要指標是綠色期；第5主成分中匍匐莖葉片長度，穗長和直立莖草層高度為主要指標（表3）。根據(jù)各表型在主成分分析中前5個主成分的權(quán)重，可以確定能代表變異的重要表型性狀：直立莖、匍匐莖的葉片寬度和長度，生殖枝的高度和穗長及綠色期。其中綠色期僅與生殖枝高度相關(guān)性相對較高，相關(guān)系數(shù)為0.34（表4），說明日本結(jié)縷草綠色期的表現(xiàn)與生殖器官和表型較營養(yǎng)器官的表型更大。

根據(jù)代表整體的前5個主成分的主要表型指標以及各表型指標間的相關(guān)系數(shù)，10個性狀中可剔除直立莖葉片長度和匍匐莖總長度這兩個分別與直立草層高度和直立莖葉片長度的相關(guān)性極高的指標（表4）。將優(yōu)選出來的8個表型指標的聚類分析與全部表型指標的聚類分析進行比較，將兩種聚類結(jié)果做相關(guān)性分析，得出相關(guān)系數(shù)為r＝0.94，P＝1.000 0，說明優(yōu)選出來的8個表型完全可以代表整體。

2.2 利用變異系數(shù)分析結(jié)縷草表型變異 依據(jù)表型數(shù)據(jù)計算變異系數(shù)，發(fā)現(xiàn)在這些表型性狀中最大的是匍匐莖的長度，為57.1%；較小的是匍匐莖葉片寬度，為6.9%（表5）。可見，在調(diào)查的這些性狀中，匍匐莖和綠色期的變異較大，葉片的長寬變異較小。

表2 表型主成分分析總方差分析Table 2 Total variance analysis of different phenotype principal component analysis

表3 各表型在各主成分的載荷系數(shù)Table 3 Load factor of each phenotype in each principal component

表4 各表型性狀相關(guān)系數(shù)矩陣Table 4 Correlation coefficient matrix of Zoysia japonica phenotypes

表5 表型指標變異系數(shù)分析Table 5 Variation coefficients of phenotype data

表6日本結(jié)縷草ISSR引物擴增條帶多樣性及特異性Table 6 Polymorphism and specificity of ISSR marker amplified Bands

2.3 利用ISSR分析日本結(jié)縷草體細胞變異ISSR檢測中，6條ISSR引物擴增出73條帶，其中多樣性條帶比例為83.6%，有5條引物多樣性條帶比例超過80%，適合對日本結(jié)縷草進行多態(tài)性檢測；單個樣品的特異帶比例為15.1%（表6）。引物ISSR1、NSSR1和NSSR17檢測出單個樣品具有的特異性條帶（表6）。由于所有樣品植株來源于同一個種子的愈傷，具有相同遺傳背景，這種特異帶的檢測具有較大的研究意義。

3 討論

3.1 結(jié)縷草體細胞變異的原因分析 植物體細胞無性系變異產(chǎn)生的影響因素有很多，這些因素有生理狀態(tài)、外植體類型、物種和基因型，再生發(fā)生方式，培養(yǎng)基中一些成分如植物生長調(diào)節(jié)劑和氮素含量以及繼代培養(yǎng)的時間。變異頻率因因素不同而異。一般來講，在長期繼代培養(yǎng)中，體細胞變異易發(fā)生［21-22］，且變異頻率相對較高。

經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)自然界內(nèi)的結(jié)縷草種內(nèi)變異現(xiàn)象十分明顯［1，16］。宣繼平等［23］通過ISSR 標記對野生結(jié)縷草屬的遺傳多樣性進行分析，結(jié)果顯示57.4%的遺傳變異存在于種內(nèi)。利用流式細胞儀對結(jié)縷草屬植物檢測2C核酸的含量，Brian等［24］發(fā)現(xiàn)結(jié)縷草屬植物有較小的基因組，因而在形態(tài)學(xué)、生長習(xí)性、生物與非生物脅迫的反應(yīng)上存在極端差異。這些發(fā)現(xiàn)都揭示結(jié)縷草變異是結(jié)縷草種的特性決定的。在日本結(jié)縷草種子誘導(dǎo)愈傷組織及愈傷長期繼代中都加入較高濃度的2，4-D，是促進變異的另一個因素［25］。長期繼代培養(yǎng)使愈傷組織處于旺盛的生長狀態(tài)，細胞不停的分裂，核酸不停的復(fù)制。頻繁的有絲分裂讓錯誤的頻率在短時間內(nèi)累計，是造成體細胞變異的又一個原因。

3.2 日本結(jié)縷草體細胞變異特征分析 本研究顯示，日本結(jié)縷草的體細胞變異中，匍匐莖的數(shù)量和長度、綠色期在體細胞變異中較大。綠色期和草坪草的擴張能力是草坪草質(zhì)量評價的重要指標，單位時間內(nèi)能發(fā)展較多的匍匐莖數(shù)量和長度也意味著更強的覆蓋能力，減少雜草的入侵，對于生長速度偏慢和綠色期偏短的結(jié)縷草來說匍匐莖的數(shù)量和長度這一變異十分重要。變異分析結(jié)果預(yù)示，有可能通過體細胞變異篩選到綠色期長、匍匐莖發(fā)達的優(yōu)異變異單株。但是葉片寬度變異系數(shù)相對較小，說明通過體細胞變異來改變?nèi)~片寬度相對困難。

自然界中，結(jié)縷草的變異同樣非常豐富，具有廣泛的地域適應(yīng)性和豐富的生態(tài)型。中國結(jié)縷草居群形態(tài)變異的研究指出匍匐莖長度是居群表型差異的主要性狀之一［26］。宣繼平和劉建秀［27］對64份中國野生結(jié)縷草生長速度的研究表明，日本結(jié)縷草的種內(nèi)匍匐莖總長度變異最大，變異系數(shù)為85.4%。綠色期的研究報道相對較少。Yaneshita等［28］在構(gòu)建RFLP遺傳圖譜的基礎(chǔ)上，對冬季葉色數(shù)量性狀基因（Quantitative Trait Locus，QTL）定位，找到了4個與冬季葉色相關(guān)的基因位點，并顯示綠色期由主效基因控制，同時體細胞變異特點為點突變較多，因而這也可以解釋本研究中為何體細胞變異中綠色期變化較大。

體細胞變異與結(jié)縷草野生資源有相似之處。對日本結(jié)縷草體細胞變異和野生資源葉片性狀變異系數(shù)進行比較，匍匐莖葉寬變異系數(shù)分別為6.9%和15.8%，匍匐莖葉長變異系數(shù)分別為13.4%和27.5%，體細胞變異系數(shù)低于野生資源的變異。這與體細胞變異本身的特點有關(guān)，在分子水平上表現(xiàn)為點突變較多，簡單的質(zhì)量性狀的變異相對可能多一些。體細胞變異的表型中，在綠色期和匍匐莖葉片長和寬表現(xiàn)出比自然條件下更大范圍的變異，因而具有較高的研究價值。

日本結(jié)縷草體細胞變異較大，通過目的性脅迫，誘導(dǎo)篩選優(yōu)質(zhì)抗逆性的草坪草植株，是培育育種中間材料或優(yōu)良品系的方法。在基因型相同的愈傷組織中遺傳背景相同的表型變異，是研究表型分子機理的優(yōu)良材料。同時，其他方式，如射線、化學(xué)誘變劑等增加變異的概率的方法，也可以獲得更多的供篩選和利用變異。Schwartz等［29］對不同性狀遺傳力做了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)縷草草坪性狀除了冬季冬眠和返青，其他性狀都具有較高的廣義遺傳力，性狀表現(xiàn)受環(huán)境影響較小，預(yù)示可將多種優(yōu)良變異的性狀合并在一起遺傳給F1代，這個研究結(jié)果使育種工作中獲得結(jié)縷草變異變得更有意義。

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