高山離子芥愈傷組織總RNA的提取方法研究

岳修樂，李爭艷，徐世健，張 華，安黎哲

（1.蘭州大學生命科學學院，甘肅 蘭州730000；2.安徽省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽 合肥230031）

隨著分子生物學的發(fā)展，越來越多的研究需要從轉(zhuǎn)錄水平上著手，深入分析研究基因的功能，如基因全長cDNA序列的克隆、基因表達模式的研究（Real-Time PCR、Northern Blotting等）、cDNA 文庫構(gòu)建、基因芯片分析、小RNA的篩選等，而獲取高質(zhì)量的RNA是這些實驗成功的第一步［1-4］。

高山離子芥（Chorisporabungeana）屬十字花科草本植物，主要分布在我國新疆天山山脈一號冰川雪線附近，常年忍受著冷凍脅迫和劇烈的溫度變化，是一種典型的冰緣植物，是研究抗凍機制的理想材料［5-9］，對于利用其抗凍基因?qū)r(nóng)作物進行抗凍性改良，提高寒流等惡劣條件下的生存率和產(chǎn)量等具有廣泛前景和深遠意義［10-11］。但是，作為低溫生物學領(lǐng)域一種比較新的研究對象，由于沒有太多借鑒，在研究時，經(jīng)常會出現(xiàn)RNA提取不穩(wěn)定、提取條件不好把握、操作繁瑣、容易降解的難題。鑒于此，本研究采用不同的提取方法、保存溫度和時間，以及提取前后的RNA酶處理等，探討高山離子芥高質(zhì)量RNA的提取方法，深入分析影響RNA質(zhì)量的關(guān)鍵因素，并對條件進行優(yōu)化，以期為冰緣植物高山離子芥的深入研究夯實基礎(chǔ)，為其他物種的RNA提取提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 高山離子芥愈傷組織 高山離子芥愈傷組織的獲取方法參照文獻［12-13］，并進行了一些修改。成熟的高山離子芥種子去皮，用70%的乙醇浸泡30s，離心后加入2%的次氯酸鈉和0.01%的TritonX-100，輕柔振蕩10min，之后離心用無菌水清洗5～7次，子葉用無菌手術(shù)刀切斷后種植于MS誘導培養(yǎng)基（MS＋1mg·L-12，4-D＋0.2 mg·L-16-BA＋30mg·L-1蔗糖＋0.6%瓊脂，pH值為5.7），獲得的愈傷組織在繼代培養(yǎng)基（MS＋0.5mg·L-12，4-D＋0.1mg·L-16-BA＋0.5mg·L-1NAA＋30mg·L-1蔗糖＋0.6%瓊脂，pH值為5.7）上進行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為18℃，16h光照8h黑暗，濕度為60%。新鮮材料直接使用或液氮速凍后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA提取前的準備工作 實驗中用到的槍頭、離心管等浸泡在0.1%的DEPC水中，1）完全浸泡：槍頭朝下浸沒在DEPC水中，離心管浸沒后，用鑷子或玻璃棒驅(qū)離殘留在管底的氣泡。2）不完全浸泡：槍頭和離心管隨意放置在玻璃容器后加入DEPC水中。室溫搖動過夜，第2天在超凈臺轉(zhuǎn)移出液體到一試劑瓶，和處理過的槍頭、離心管、干凈的研缽、鑷子等一起高溫（121℃）滅菌30min。超凈臺、移液器等工具用75%乙醇擦拭備用。

1.3 RNA的提取

1.3.1 改良的Trizol法 根據(jù)Invitrogen公司Trizol試劑說明書［14］，稱取100mg新鮮的高山離子芥愈傷組織（或保存在-80℃的樣品），放入液氮預(yù)冷過的研缽中，添加液氮，研磨至粉末狀，研磨過程中不要使液氮干掉；加入1mL Trizol試劑到研缽中，Trizol試劑遇冷會凝固，繼續(xù)研磨至Trizol完全融化成液體，這時樣品應(yīng)均勻混合在試劑中。自研缽吸取混合液到一支新1.5mL離心管中，加入200 μL氯仿，劇烈震蕩混勻20～30s，室溫靜置5min，4℃14 000r·min-1離心10min，吸上清約500μL到一支新離心管中，加入等體積的酚／氯仿／異戊醇（25∶24∶1，pH 值5.1），再次劇烈震蕩20～30s，室溫靜置5min，然后4℃14 000r·min-1離心15 min。離心后，吸上清約400μL到一支新離心管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置3～5 min后4℃10 000r·min-1離心10min；棄上清，加入1mL 75%的乙醇，顛倒使白色沉淀懸浮，4℃10 000r·min-1離心5min；重復用75%的乙醇洗鹽一次，操作同上一步；然后棄上清，用移液槍吸干殘留的液體，超凈臺內(nèi)風干10min，加DEPC水50 μL溶解，直接使用或-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 CTAB 法 參照李高等［15］及 Chang等［16］的方法。稱取100mg新鮮組織在液氮中充分研磨成粉末狀，加入650μL CTAB提取液［2%CTAB，2 mol·L-1NaCl，2%PVP，0.1mol·L-1EDTA（pH 值8.0），25mmol·L-1EDTA（pH 值8.0），2%巰基乙醇］，立即振蕩混勻，65℃水浴10min，期間每2min上下顛倒1次；加入等體積的酚／氯仿／異戊醇（25∶24∶1，體積比），劇烈震蕩30s，4℃14 000r·min-1離心15min；吸上清到一支新的無RNase的1.5mL離心管中，加入等體積的氯仿／異戊醇（24∶1，體積比），再次劇烈震蕩30s，4 ℃14 000r·min-1離心15min；吸上清到一支新的無RNase的1.5mL離心管中，加入DNase I進行消化（參照NEB公司DNase I試劑說明，Catalog No.M0303L），37℃水浴1h。充分消化后，加入等體積的氯仿／異戊醇（24∶1，體積比），劇烈震蕩30s，4℃14 000r·min-1離心15min；上清液轉(zhuǎn)移到另一支新的無RNase的1.5mL離心管中，加入1／3體積的8mol·L-1LiCl，顛倒混勻，-20℃ 靜置2h；之后，4℃14 000r·min-1離心20min，棄上清，加入1mL 70%乙醇，上下顛倒混勻，4℃10 000 r·min-1離心5min。室溫晾干，加入50μL DEPC水溶解沉淀。

1.3.3 柱式離心法 操作完全按照Tiangen公司總RNA提取試劑盒說明書（Tiangen總RNA提取試劑盒，Catalog No.DP419）。

1.4 RNA的檢測

1.4.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測 用去離子水配置0.4 mol·L-1的NaOH，浸泡電泳槽、制膠板及制膠梳，30min以上，之后用DEPC水清洗，用DEPC水配置電泳緩沖液，在DEPC水處理過的三角瓶中配置1%的瓊脂糖凝膠，電泳檢測RNA的質(zhì)量。出現(xiàn)清晰的3條帶，第1條帶（28SrRNA）是第2條帶（18S rRNA）的2倍亮度為最佳［17］。

1.4.2 吸光度分析 取2μL提取的RNA稀釋50倍，用微量比色皿對RNA在260、280和230nm的吸光度進行檢測。OD260／OD280在1.8～2.0為佳，OD260／OD230大于1.8為佳［17-18］。

1.4.3 RT-PCR檢測 取2μg經(jīng)DNA酶（Formentas，Catalog No.EN0521）消化過的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，方法參照 M-MuLV Reverse Transcriptase 產(chǎn) 品 手 冊 （Formentas，Catalog No.EP0351）。以1μL反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，擴增高山離子芥看家基因CbACTIN（GeneBank Accession No.AY82536）來檢測RNA質(zhì)量對后續(xù)研究的影響，CbACTIN的引物為，

擴增條件為94℃ 預(yù)變性2min；94℃變性30s，55℃退火40s，72℃延伸1min，共30個循環(huán)。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.5 RNA的保存 分別采用室溫（25℃）、-80℃保存RNA，在特定的時間進行電泳檢測，來觀察保存溫度對RNA造成的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法提取RNA結(jié)果分析

2.1.1 RNA純度和得率 Trizol法、柱式離心法和CTAB法提取高山離子芥RNA，得到的RNAOD260／OD280分別在1.88～1.95、1.92～1.98和1.38～1.42，OD260／OD230分別在 2.03～2.21、1.95～2.31和0.83～1.23（表1）。說明柱式離心法得到的RNA純度最高；改良Trizol法的純度和柱式離心法的非常接近，也比較純，可以滿足各種后續(xù)研究對RNA的要求；CTAB法純度較低，對于很多后續(xù)的實驗要求都很難滿足。改良Trizol法、柱式離心法和CTAB法得率分別在29.6～35.2、14.8～17.9和17.5～23.3μg·g-1（表1）。改良Trizol法的得率最高，柱式離心法的得率最低，對于需要大量RNA的后續(xù)研究，改良Trizol法是最佳選擇。

表1 不同方法提取RNA的吸光度檢測Table 1 OD value of extracted RNA by different methods

2.1.2 RNA完整性分析 改良Trizol法和柱式離心法都能獲得較高質(zhì)量的RNA，尤其是改良Trizol法提取的RNA完整性最好，條帶清晰，28SrRNA條帶亮度接近18SrRNA的2倍（圖1）。CTAB法得到的RNA條帶出現(xiàn)一定程度的降解。

圖1 3種不同的方法提取高山離子芥RNA得到的電泳圖Fig.1 Electropherogram of RNA from three different extraction methods

2.1.3 RT-PCR檢測結(jié)果 將3種不同的方法提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板擴增高山離子芥看家基因CbACTIN。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，改良的Trizol法和柱式離心法均能得到較好的擴增效果，而CTAB法得到的條帶非常弱，擴增效果比較差，難以達到后續(xù)實驗的要求（圖2）。

圖2 高山離子芥看家基因CbACTIN擴增后的電泳圖Fig.2 Electropherogram of Chorispora bungeana housekeeping gene CbACTIN

2.2 槍頭、離心管去RNA酶處理不完全的結(jié)果 比較槍頭、離心管不完全浸泡和完全浸泡DEPC水對RNA質(zhì)量造成的影響，完全浸泡可以得到比較清晰的條帶，而不完全浸泡則發(fā)生大量降解（圖3）。

2.3 保存條件對RNA的影響 溶解在水中的RNA保存在室溫時，在8h后出現(xiàn)少量降解，20h后已經(jīng)大部分開始降解（圖4），所以最好8h以內(nèi)使用，否則將會影響下游的實驗；而在-80℃的RNA則可以保存較長的時間，至少30d之內(nèi)使用沒有問題（圖5）。

圖3 槍頭、離心管等去RNA酶處理對RNA質(zhì)量的影響Fig.3 The influence of residual RNase on RNA integrity

圖4 室溫保存不同時間對RNA的影響Fig.4 The influence of different storage time at room temperature on RNA integrity

2.4 電泳槽及電泳液去RNA酶處理前后RNA電泳的結(jié)果 在去RNA酶處理后進行的電泳，條帶清晰，沒有發(fā)生降解；而在沒有處理的條件下進行的電泳，RNA基本完全降解（圖6）。

3 討論與小結(jié)

圖5 －80℃保存30d對RNA的影響Fig.5 The influence of 30days storage at－80℃on RNA integrity

圖6 電泳槽和電泳液RNA酶滅活處理前后對RNA電泳結(jié)果的影響Fig.6 The influence on RNA electrophoresis results before and after RNase inactivation treatment in electrophoresis tank and solution

3.1 提取方法的選擇 物種不同，往往其體內(nèi)的各物質(zhì)含量也不盡相同［19-21］，蛋白質(zhì)、酚類、多糖等物質(zhì)的含量高低，是影響RNA提取質(zhì)量的重要因素［17］，這就要求研究人員根據(jù)物種的具體情況調(diào)整RNA提取的方法和步驟，采取最合適的方法提取高質(zhì)量的RNA，從而保證后續(xù)研究的可靠性。高山離子芥作為一種冰緣植物，具有極強的抗寒能力，分析檢測證明其體內(nèi)含有較高的脯氨酸及可溶性多糖的含量［22-23］。本研究分別采用改良的Trizol法、柱式離心法和CTAB法對高山離子芥進行RNA的提取，結(jié)果證明，改良的Trizol法、柱式離心法都可以得到較高質(zhì)量的RNA，但是前者有更高的RNA得率，考慮到分離柱對RNA的大小具有選擇性，對特定范圍內(nèi)的RNA有較好的吸附能力，特別大或特別小的RNA則很難吸附甚至無法吸附。所以，建議采用改良的Trizol法來提取高質(zhì)量的RNA，進行后續(xù)的研究。在對RNA的要求較低時可以考慮采用柱式離心法。而CTAB法表現(xiàn)出操作繁瑣、耗時長、提取質(zhì)量不高的弱點，不建議采用。

3.2 槍頭、離心管的處理對RNA質(zhì)量的影響在提取RNA之前要用DEPC水浸泡槍頭、離心管等直接和RNA接觸的工具，滅活RNA酶，如果處理不充分將會造成RNA的降解。然而，簡單的把槍頭和離心管放入DEPC水中并不能做到完全的浸泡，致使實驗失敗仍難于找出原因，這主要是由于槍頭、離心管等塑料器具，在DEPC水中浸泡時，會飄浮起來，或者在離心管底殘留氣泡，即使長時間搖動也很難去除，所以，這和沒有經(jīng)過DEPC水處理的槍頭、離心管并無區(qū)別，導致實驗失敗。本研究改良的方法是：對于槍頭，選用較細的試劑瓶，使槍尖朝下保持豎直浸沒在DEPC水中；對于離心管，在浸沒DEPC水中之后，用長鑷子或細玻璃棒在有氣泡的離心管底部輕輕攪拌，逐一驅(qū)離氣泡，保證完全浸沒，達到滅活RNA酶的效果。

3.3 樣品品質(zhì)對RNA品質(zhì)的影響 樣品的品質(zhì)相當于先天性因素，沒有好的樣品品質(zhì)就難以提取高品質(zhì)的RNA，所以RNA的提取一定要盡量選用新鮮材料，或者采集后液氮速凍-80℃短期保存的材料。另外，樣品要選取新鮮部位的組織，不要采集衰老部位的組織。對于提取RNA時樣品的起始量上，一定要保證100mg樣品加入1mL Trizol，超出這個量很可能會造成RNA降解、抽提不干凈、蛋白質(zhì)或無機物污染等。

3.4 電泳試劑去RNA酶的處理對RNA檢測的影響 電泳液及電泳槽等工具對RNA完整性的檢測結(jié)果也有著重要影響，處理不好會使檢測結(jié)果不能真實反映提取的RNA質(zhì)量，本研究比較了電泳槽經(jīng)0.4mol·L-1的氫氧化鈉浸泡30min以及用DEPC水配置的緩沖液進行電泳和不作這些處理進行的電泳，結(jié)果顯示，在沒有處理的電泳槽里跑的RNA基本上完全降解，說明電泳試劑及工具的RNA酶滅活是影響檢測結(jié)果非常大的因素，這一步RNA酶的滅活不容忽視。

3.5 保存條件對RNA的影響 在提取RNA后，需要進行質(zhì)量的檢測以及定量分析，有時還需進行酶切消化再提純等的操作，這會消耗一定的時間，針對長時間操作后RNA質(zhì)量是否完好的問題，本研究進行了室溫和-80℃的保存檢測，實驗證明，提取之后溶解在水中的RNA可以在-80℃保存較長的時間，30d之內(nèi)使用質(zhì)量仍較好，而保存在室溫的RNA則最好在8h以內(nèi)使用，超過8h之后，RNA的完整性則難以保證。

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