Sirt1和P55PIK 在胃癌中的表達(dá)及臨床意義

張 波， 王敬濤， 閔 江， 陶德定， 李小蘭， 胡俊波， 龔建平， 嚴(yán) 群

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院胃腸外科中心，武漢 430030

在世界范圍內(nèi)胃癌居癌癥發(fā)病率的第4位，全球每年因胃癌死亡約80萬人，其中中國(guó)占35%，是胃癌發(fā)病率和死亡率最高的國(guó)家之一。由于該病不易早期發(fā)現(xiàn)，且臨床病情進(jìn)展迅速，因此已引起人們的高度重視。

Sirt1是Ⅲ型組蛋白去乙?；钢?，在體內(nèi)可將組蛋白及多種非組蛋白去乙酰化，調(diào)節(jié)基因表達(dá)及蛋白質(zhì)功能［1－2］。研究發(fā)現(xiàn)，Sirt1 可以促進(jìn)腫瘤形成，主要通過去乙?；饔茫种屏巳鏿53［3］、NFκB［4］等的凋亡調(diào)節(jié)作用。P55PIK 是PI3Ks（Phosphoinositide 3－kinases）的一個(gè)調(diào)節(jié)亞基。P55PIK可與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（Retinoblastoma，Rb）蛋白特異性結(jié)合并參與Rb蛋白對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控［5］。有研究發(fā)現(xiàn)，抑制P55PIK 的功能能夠抑制胃癌、肝癌和甲狀腺癌等腫瘤的生長(zhǎng)。

本研究采用免疫組織化學(xué)技術(shù)和蛋白印跡技術(shù)檢測(cè)Sirt1和P55PIK 在胃癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)水平，旨在分析其與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系，明確Sirt1和P55PIK 在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2010年～2012 年華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院胃腸外科手術(shù)切除的45 例胃癌標(biāo)本，全部病例均有完整的臨床病理資料。其中男性27例，女性18例，患者平均年齡53.4歲。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者32 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者13 例。TNM 分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分別7、8、19、11 例（參照2010年NCCN 胃癌分期標(biāo)準(zhǔn)）。所有患者術(shù)前均未接受化療、放療和免疫治療等。同時(shí)取此45例患者癌旁正常胃組織（距腫瘤邊界5cm 以上）作為對(duì)照。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 組織切片置于68℃下脫蠟3 min，隨后以二甲苯溶液Ⅰ、Ⅱ各浸泡10 min。依次以100%、95%、75%的乙醇漂洗水化，每次各5min，以ddH2O 沖刷至無二甲苯氣味，TBST平衡10 min。切片置于3%H2O2孵育15 min，ddH2O 沖刷，TBST 平衡5min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。切片置于pH 6.0沸騰枸櫞酸鈉緩沖液中20 min。Blocking Solution室溫封閉30min，分別加入兔源性Sirt1 抗體（Cell Signaling 公司，1∶100 稀釋）和羊源性P55PIK 抗體（Santa Cruz公司，1∶100稀釋）4℃過夜。將切片放于流水容器中振蕩20次，再放入TBST 中振蕩20次，平衡5min。TBST稀釋二抗，室溫孵育30min。將切片放于TBST 中振蕩20次，平衡5min。DAB顯色6min，避光。自來水沖洗。蘇木精染色3～4 min，自來水沖洗。1%鹽酸乙醇分化，浸一下至切片變藍(lán)即可，清水沖洗。1%氨水返藍(lán)，看到切片變藍(lán)即可，清水沖洗。切片以蓋玻片密封脫水。

1.2.2 免疫組化結(jié)果分析 Sirt1評(píng)分依據(jù)半定量IRS方法，評(píng)分結(jié)果由染色深度與鏡下染色面積比例相乘得到。在高倍視野下，①按腫瘤細(xì)胞顯色的比例評(píng)分，＜25%為0分，25%～50%為1分，51%～75%為2分，＞75%為3分；②按腫瘤細(xì)胞著色強(qiáng)度評(píng)分，無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，每例最終評(píng)分等于①×②。最終結(jié)果0～3分為陰性，≥4分為陽(yáng)性。

1.2.3 Western blot檢測(cè) 隨機(jī)選取15例胃癌患者手術(shù)切除標(biāo)本的腫瘤組織及癌旁正常組織。將組織置于液氮中冷凍，后迅速放于研缽中研磨成粉末狀，移置EP管中，加入含有蛋白酶抑制劑的裂解液（RIPA），置于冰上，超聲波振蕩3次，每次10s，后冰上靜置10min。置于低溫高速離心機(jī)12 000r／min，4℃，離心10min，取上清，以BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。加入溴酚藍(lán)后放入100℃，5min變性。制備10%聚丙烯酰胺凝膠，取等量樣品上樣于聚丙烯酰胺凝膠，電泳（60 V，30 min；120V，130min），至溴酚藍(lán)跑到膠底部。將聚丙烯酰胺凝膠經(jīng)過轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)至0.45μm PVDF膜上，用5%的脫脂牛奶封閉該P(yáng)VDF 膜60 min，以TBST 溶液洗膜3 次，以1%BSA 溶液1∶1 000稀釋兔源Sirt1抗體（Cell Signaling公司），1∶500 稀釋羊源P55PIK 抗體（Santa Cruz公司），封閉相應(yīng)蛋白條帶，置搖床4℃過夜。用TBST 振蕩洗滌膜4次，10 min／次，以5%脫脂牛奶1∶2 000 稀釋HPR 標(biāo)記的兔羊二抗，常溫?fù)u床上孵育PVDF膜，120min后以TBST 徹底洗滌膜6 次，10 min／次。加入顯色液（Thermo公司）于凝膠成像系統(tǒng)中曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 12.0分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)分析，相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Sirt1和P55PIK 蛋白的表達(dá)情況

Sirt1和P55PIK 主要定位于細(xì)胞核，故其陽(yáng)性著色細(xì)胞，細(xì)胞核呈黃色或棕黃色，且不同病理切片染色深度不同，根據(jù)腫瘤細(xì)胞著色強(qiáng)度評(píng)分列出不同染色深度的圖像（見圖1）。45例胃癌及癌旁正常組織中Sirt1陽(yáng)性表達(dá)率分別為55.56%（25／45）和24.44%（11／45），兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。45例胃癌及癌旁正常組織中P55PIK 陽(yáng)性表達(dá)率分別為64.44%（29／45）和35.56%（16／45），兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 Sirt1和P55PIK 表達(dá)與胃癌臨床病理特點(diǎn)之間的關(guān)系

45例胃癌組織中，Sirt1及P55PIK 蛋白表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤直徑及浸潤(rùn)深度無明顯相關(guān)性（P＞0.05），而與胃癌TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（見表1）。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者Sirt1、P55PIK 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者高（P＜0.05），Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者之間Sirt1、P55PIK 蛋白表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

圖1 Sirt1和P55PIK 免疫組化著色強(qiáng)度評(píng)分（SP，×200）Fig.1 Immunohistochemistry of Sirt and P55PIK expression（SP，×200）

2.3 Western blot檢測(cè)Sirt1和P55PIK 的表達(dá)

隨機(jī)選取15例胃癌患者手術(shù)標(biāo)本腫瘤組織及癌旁正常組織，提取組織蛋白行Western blot檢測(cè)（圖2），結(jié)果顯示在15 例患者中有9 例患者Sirt1在胃癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織，所占比例為60.0%；有10例患者P55PIK 在胃癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織，所占比例為66.67%；有8例患者的Sirt1和P55PIK 在胃癌組織中的表達(dá)均高于癌旁組織，所占比例為53.33%，這說明Sirt1和P55PIK在腫瘤組織蛋白中的表達(dá)具有相關(guān)性。通過灰度分析得出（圖3），15例患者中Sirt1和P55PIK 在胃癌組織中的平均灰度值明顯高于癌旁正常組織。

圖2 15例患者中Sirt1和P55PIK 的蛋白表達(dá)水平Fig.2 The protein expression level of Sirt1and P55PIK in 15patients

表1 Sirt1和P55PIK 在胃癌中的表達(dá)與臨床病理特點(diǎn)之間的關(guān)系Table 1 Correlations of Sirt1and P55PIK expression to clinicopathologic features of gastric cancer

圖3 15例患者Sirt1和P55PIK 蛋白表達(dá)水平的比較Fig.3 The gray values of Sirt1and P55PIK protein expression levels in 15patients

2.4 胃癌組織中Sirt1、P55PIK 表達(dá)相關(guān)性

在45例胃癌組織中，25例Sirt1表達(dá)陽(yáng)性者中20例P55PIK 表達(dá)陽(yáng)性，20例Sirt1表達(dá)陰性者中11例P55PIK 表達(dá)陰性，根據(jù)Spearman相關(guān)性分析得出兩者在胃癌組織中表達(dá)呈正相關(guān)（χ2＝5.940，r＝0.363，P＝0.015）。

3 討論

Sirt1是Ⅲ型去乙?；M蛋白中的一員，與酵母菌中的sir2是同源物。Sirt1在限制能量攝入過程中被激活，與延長(zhǎng)細(xì)胞壽命有關(guān)系［1］。但在Sirt1與腫瘤關(guān)系的研究中，其作用尚未得到統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)。研究發(fā)現(xiàn)，Sirt1通過組蛋白修飾增加基因組的穩(wěn)定性，通過與Bax，Bcl2蛋白家族相聯(lián)系影響著細(xì)胞周期進(jìn)展［2］。在人體內(nèi)Sirt1 能夠結(jié)合并去乙酰化p53蛋白［6］，而這種結(jié)合對(duì)p53 蛋白的去乙?；淖兗皩?duì)p53作為一個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子的功能產(chǎn)生了巨大影響，直接影響了p53的抑癌功能［7］。同時(shí)Sirt1通過與Bax、NF－κB、Ku、E2F1、FOXO 等凋亡蛋白的直接結(jié)合而使細(xì)胞壽命延長(zhǎng)，并且誘導(dǎo)NBS1蛋白去乙?；{(diào)節(jié)細(xì)胞DNA 損傷信號(hào)通路，使得細(xì)胞壽命延長(zhǎng)，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。在對(duì)多種體外培養(yǎng)細(xì)胞應(yīng)用Sirt1激活物后都可以觀察到細(xì)胞平均壽命延長(zhǎng)［8］，相反，當(dāng)通過RNAi技術(shù)抑制Sirt1蛋白表達(dá)后，可以明顯觀察到細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡。在高表達(dá)Sirt1的轉(zhuǎn)基因老鼠中，由于ApcMin的突變而使得腸癌的發(fā)生減少，并且Sirt1可使βcatenin去乙?；瑥亩种颇[瘤細(xì)胞的增殖，這表明Sirt1尚有抑制腫瘤生長(zhǎng)的功能。

磷脂酰肌醇3－激酶（PI3Ks）是連接細(xì)胞外信號(hào)和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的重要信號(hào)分子，在細(xì)胞的增殖、凋亡、分化、物質(zhì)代謝中發(fā)揮重要功能［9－10］。P55PIK是PI3Ks的一個(gè)調(diào)節(jié)亞基。P55PIK 可與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Retinoblastoma，Rb）特異性結(jié)合并參與Rb 蛋白對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控［5］。有報(bào)道稱P55PIK 在卵巢癌中表達(dá)顯著升高，下調(diào)P55PIK 的表達(dá)可抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖。有研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，抑制P55PIK 的功能能夠抑制胃癌、肝癌和甲狀腺癌等腫瘤的生長(zhǎng)［11－12］。同時(shí)抑制P55PIK 的功能能夠有效抑制胃癌細(xì)胞的增殖和遷移［13］。這些研究結(jié)論均提示P55PIK 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有重要功能。

在腫瘤的發(fā)生過程中PI3K 和Sirt1在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和抑制凋亡中都發(fā)揮著重要作用，P55PIK 作為PI3Ks的一個(gè)重要的調(diào)節(jié)亞基，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中同樣發(fā)揮著重要的作用。在細(xì)胞中PI3Ks信號(hào)通路可調(diào)節(jié)Sirt1的表達(dá)［14］，使其發(fā)揮不同的作用，那作為PI3Ks信號(hào)通路重要的調(diào)節(jié)亞基的P55PIK 是否也參與Sirt1的調(diào)節(jié)，目前還沒有相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)。根據(jù)我們實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果，免疫共沉淀顯示Sirt1和P55PIK 在細(xì)胞中存在相互作用。本實(shí)驗(yàn)旨在通過檢測(cè)臨床腫瘤標(biāo)本中Sirt1和P55PIK 的表達(dá)水平，分析兩者之間是否存在相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)證明Sirt1和P55PIK 在胃癌組織中明顯高表達(dá)，且跟胃癌TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。在胃癌組織中兩者存在共表達(dá)現(xiàn)象，且表達(dá)強(qiáng)度呈正相關(guān)性，推測(cè)兩者協(xié)同作用對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著重要的作用，聯(lián)合檢測(cè)可作為判斷胃癌的預(yù)后和篩選高危轉(zhuǎn)移患者的指標(biāo)，并可作為有效的治療靶點(diǎn)。

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