牙周膜成纖維細(xì)胞與靜電紡絲納米纖維的生物相容性研究

白 軼， 陳 亮， 施 斌

1 武漢大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)院種植科，武漢 430079

2 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院泌尿外科，武漢 430030

牙周膜成纖維細(xì)胞（periodontal ligament fibroblast，PDLF）來源于中胚層，是牙周組織中主要的結(jié)締組織細(xì)胞，能夠參與牙周組織損傷后的修復(fù)，同時，PDLF 也是一種具有多項(xiàng)分化潛能的多能干細(xì)胞，具有形成牙骨質(zhì)、牙槽骨和牙周韌帶的能力，是牙周組織修復(fù)再生的基礎(chǔ)［1］。傳統(tǒng)的牙周膜損傷多采用引導(dǎo)組織再生術(shù)（GTR）進(jìn)行修復(fù)治療，雖可取得一定的效果，但由于所采用的聚四氟乙烯（PTFE）膜很難降解吸收，因此需再次手術(shù)去除［2］，給患者帶來二次手術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)和痛苦。

隨著生物技術(shù)和材料科學(xué)的發(fā)展，以“細(xì)胞＋支架”模式為核心的組織工程［3］，為解決這一問題提供了一種新的途徑。細(xì)胞是種子，是修復(fù)組織的主體；支架是載體，為細(xì)胞生長提供臨時的場所和三維模板。近年來，人工高分子聚合物在組織工程支架中的應(yīng)用越來越廣。其中，聚乳酸［poly（L－lactic acid），PLA］和聚己內(nèi)酯［poly（ε－caprolactone），PCL］都是經(jīng)美國FDA 批準(zhǔn)的生物醫(yī)用材料。聚乳酸脆性大，機(jī)械性好，生物降解速度快［4］。而聚己內(nèi)酯韌性強(qiáng)，機(jī)械性差，降解速度慢。通過調(diào)節(jié)兩者的合成比例可實(shí)現(xiàn)對聚合物性狀的調(diào)節(jié)，以滿足特異性組織的生物降解和力學(xué)要求。

靜電紡絲技術(shù)是一種制備高分子聚合物支架的簡便方法，該技術(shù)的基本原理是聚合物溶液在高壓電場中靜電霧化，噴射后拉伸成極細(xì)的纖維，其制備的支架纖維可達(dá)納米級，可模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，是獲得納米級纖維的有效方法［5］。

本實(shí)驗(yàn)利用兩種材料近似“互補(bǔ)”的特性，按3種比例混合后經(jīng)靜電紡絲技術(shù)合成支架，通過研究支架與牙周膜成纖維細(xì)胞的生物相容性，篩選最佳的聚合物合成比例，探索其作為牙周膜組織工程支架的可行性。

1 材料與方法

1.1 靜電紡絲

靜電紡絲納米纖維支架由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院泌尿外科提供，簡述制備過程如下［6］：聚乳酸（PLA，Mw＝100 000，深圳光華偉業(yè)，中國）和聚己內(nèi)酯（PCL，Mw ＝1 000，Slovery，韓國）按不同質(zhì)量比（75∶25，50∶50，25∶75）溶于氯仿／甲醇混合液，調(diào)整聚合物溶液濃度至10%（質(zhì)量百分比），磁力攪拌4h至完全溶解。將混合物溶液加至與靜電紡絲儀噴絲頭（內(nèi)徑0.46 mm）連接的注射器中，電壓設(shè)為20kV，注射器流量泵速1.0 mL／h，聚合物溶液帶電噴射成絲后落在一接地鋁箔上，噴絲頭與鋁箔垂直距離15cm。所得材料置于干燥箱內(nèi)干燥3d。實(shí)驗(yàn)前，揭下鋁箔上的薄膜即為納米纖維支架。上述實(shí)驗(yàn)中所用化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定

人牙齒拔除后立即置于含1%三抗（青霉素、鏈霉素、慶大霉素，Sigma－Aldrich，USA）的DMEM（Gibco，USA）培養(yǎng)液中，無菌條件下用無血清DMEM 培養(yǎng)液充分洗滌3次，刮取根中1／3的健康牙周膜，置于含三抗的DMEM 液內(nèi)，將組織塊剪成約1mm×1mm×1mm 大小，移入25mL 培養(yǎng)瓶（Corning，USA）中，倒置培養(yǎng)瓶于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中1h 后，加入含10%胎牛血清（Hyclone，USA）和1%三抗的DMEM 培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。隔日換液，1周后小心去除組織塊，用2.5 g／L 胰蛋白酶消化（Invitrogen，USA），用含10%胎牛血清（Hyclone，USA）和1%三抗的DMEM 培養(yǎng)液終止消化并重懸細(xì)胞，靜置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)，至細(xì)胞長滿瓶底80%時常規(guī)傳代。

采用波形蛋白免疫熒光法鑒定PDLF。方法如下：取第2代PDLF，胰酶消化后接種到蓋玻片上（5×105／mL），在5%CO2、37℃條件下孵育1d。經(jīng)PBS液漂洗、4%多聚甲醛溶液（Invitrogen，USA）固定、0.1%Triton X－100（Sigma－Aldrich，USA）透化、5%BSA 溶液（Sigma－Aldrich，USA）封閉后，加入兔抗人波形蛋白一抗（Boster，China）工作液并在4℃條件下過夜，次日取出，漂洗后加入羊抗兔Cy3二抗（Beyotime，China）工作液孵育60min，再次漂洗，熒光顯微鏡（TE2000，Nikon，Japan）下觀察。

1.3 細(xì)胞接種

3種比例的支架材料分為3 個實(shí)驗(yàn)組：75∶25組、50∶50組、25∶75組。支架材料均裁剪成直徑5mm 的小圓片，浸入75%乙醇后移入無菌操作臺，浸泡1h，使用前PBS漂洗10s×3次，平鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Costar，USA）孔底，3種支架各自設(shè)5個復(fù)孔，在同一行設(shè)置無支架的5 個對照孔，實(shí)驗(yàn)孔、對照孔均加入胰酶消化后的第3代PDLF 細(xì)胞懸液（5×104／mL）200μL。平行試驗(yàn)共制備11塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，同時放入5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.4 形態(tài)學(xué)觀察

接種后1、3、7d，取同一塊96孔板，在光學(xué)顯微鏡下觀察PDLF 在各比例納米纖維支架上的形態(tài)變化。

1.5 細(xì)胞增殖檢測

接種后的1～7d，按MTT 細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性試劑盒說明書（Beyotime，China）操作連續(xù)檢測，實(shí)驗(yàn)孔、對照孔每孔加入10μL MTT 溶液，在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4h。之后每孔加入100μL Formanzan溶解液，再繼續(xù)孵育4h，酶標(biāo)儀記錄570 nm 波長下的吸光度（A）值。

1.6 細(xì)胞粘附檢測

接種后12h和24h，各取1塊96孔板，將實(shí)驗(yàn)孔樣品經(jīng)PBS液漂洗15s后，置于蓋玻片上并轉(zhuǎn)入一新6孔板（Costar，USA），加入等量含100ng／mL DAPI的DMEM 培養(yǎng)液（含10%胎牛血清和1%三抗），培養(yǎng)箱中孵育4h，PBS液漂洗15s×6次，蓋玻片在熒光顯微鏡下（TE2000，Nikon，Japan）觀察成像，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.7 細(xì)胞活性檢測

接種后7d，取一96孔板，將實(shí)驗(yàn)孔樣品經(jīng)PBS液漂洗15s后，轉(zhuǎn)移至蓋玻片上，用含10μg／mL Hoechst 33342（Beyotime，China）和0.5mg／mL 碘化丙啶（PI，Beyotime，China）的PBS 液孵育30 min，在激光共聚焦顯微鏡下檢測成像。Hoechst 33342顯示藍(lán)色標(biāo)示活細(xì)胞，PI顯示紅色標(biāo)示死細(xì)胞。計(jì)數(shù)活、死細(xì)胞數(shù)量（N活、N死），計(jì)算活細(xì)胞百分率，即P活＝N活／（N活＋N死）×100%。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，3 組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）法，兩兩比較采用配對t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定

光鏡下，成纖維細(xì)胞輪廓清楚，胞體大，形態(tài)多樣，有紡錘形、多角形或扁平星形，胞核為卵圓形，細(xì)胞周圍基質(zhì)分泌旺盛，見圖1A。免疫熒光示成纖維細(xì)胞胞體高表達(dá)波形蛋白，見圖1B。

圖1 成纖維細(xì)胞形態(tài)及鑒定Fig.1 The morphology and characterization of PDLF

2.2 形態(tài)學(xué)觀察

隨著培養(yǎng)時間的延長，PDLF 在支架上數(shù)量逐漸遞增。接種后1d細(xì)胞經(jīng)消化后接種到支架上初始時為圓形或卵圓形，3～7d，胞體逐漸展開，粘附于纖維之上，可見50∶50組支架上PDLF數(shù)量較其他兩種支架多，細(xì)胞在支架上分布最密集，75∶25組次之，25∶75組支架上細(xì)胞數(shù)量最少，見圖2。

2.3 細(xì)胞增殖

圖2 PDLF在不同比例支架上的形態(tài)觀察Fig.2 Morphology of PDLF on scaffolds with different weight ratios

MTT 法檢測結(jié)果A 值與細(xì)胞數(shù)量呈正比。各組細(xì)胞增殖曲線趨勢基本相同，見圖3，1～2d為緩慢增殖期，3～5d為快速增殖期，6～7d為平臺期。增殖初期，支架上的PDLF 增殖速度與對照組細(xì)胞近似，甚至更快。之后，50∶50組PDLF 增殖快于其他兩組和對照組細(xì)胞，3實(shí)驗(yàn)組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），75∶25組和25∶75組支架組細(xì)胞較對照組增殖速度慢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），50∶50組后期細(xì)胞增殖速度較對照組慢，但總體比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 細(xì)胞粘附

接種12h和24h后，50∶50組支架上粘附的PDLF較75∶25組和25∶75組多，見圖4。接種12h后各組粘附細(xì)胞數(shù)量比較，50∶50組與75∶25組和25∶75 組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），而75∶25組和25∶75組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。接種24h后各組間粘附數(shù)量分析，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖5。

圖3 MTT 法檢測細(xì)胞增殖Fig.3 Cell proliferation examined by MTT assay

圖4 熒光成像示PDLF在不同比例支架上的粘附Fig.4 Attachment of PDLF on scaffolds with different weight ratios by fluorescence imaging

圖5 PDLF在不同比例支架上的粘附細(xì)胞數(shù)比較Fig.5 Comparison of attached PDLF on scaffolds with different weight ratios

2.5 細(xì)胞活性

活死細(xì)胞染色可在一個圖片上同時顯示活細(xì)胞（藍(lán)色）和死細(xì)胞（紅色），見圖6。根據(jù)圖片計(jì)數(shù)不同比例支架上的活死細(xì)胞數(shù)，得到各自的活細(xì)胞比例，代表細(xì)胞的活性。50∶50組支架上的活細(xì)胞比例（76.5±9.2）%較75∶25組（68.8±10.2）%和25∶75組（53.4±8.4）%多，其紅染的死細(xì)胞量相對較少。統(tǒng)計(jì)分析表明，3組間總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），兩兩比較各組間差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

圖6 活死細(xì)胞染色示PDLF在不同比例支架上的活性Fig.6 Viability of PDLF on scaffolds with different weight ratios by Live／Dead staining

3 討論

已有研究表明，靜電紡絲聚乳酸／聚己內(nèi)酯納米纖維具有很好的細(xì)胞相容性［3，7－8］，但其與牙周膜成纖維細(xì)胞的相容性尚缺乏文獻(xiàn)報(bào)道。這種纖維具有納米級的纖維直徑和孔隙，可為細(xì)胞增殖、粘附提供充足的空間和營養(yǎng)、信號交換。隨著2種聚合物的合成比例的變化，纖維的三維結(jié)構(gòu)必然發(fā)生改變［9］，這種改變是否適合細(xì)胞生長，是本實(shí)驗(yàn)需要解決的問題之一。同時，通過研究各種比例支架對細(xì)胞生長的影響，探索出聚合物納米支架最佳的合成比例。

在增殖檢測中，實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞均顯示出相似的增殖曲線，說明PDLF 能夠在各種比例的支架上生長。在接種后的1～2d，支架上PDLF 數(shù)量甚至超過常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞，這可能是由于納米纖維支架提供了更大的表面積和三維空間，使更多的細(xì)胞得以粘附。隨著時間的推進(jìn)，75∶25支架和25∶75支架的細(xì)胞增殖速度明顯遜于對照組，這可能是由于材料的降解，聚合物降解后CO2的堆積致使細(xì)胞外液酸性增大，限制了細(xì)胞的生長。50∶50支架在接種3～5d后增殖速度一度超過對照組，說明其受影響較小，但最終還是不及常規(guī)培養(yǎng)下的細(xì)胞。但這表明50∶50支架組是最接近PDLF 生理?xiàng)l件下細(xì)胞外基質(zhì)的。

本研究通過細(xì)胞計(jì)數(shù)直接比較各組間細(xì)胞的粘附能力。結(jié)果表明50∶50支架上的PDLF 粘附數(shù)量多于其他兩種比例的支架，最接近正常培養(yǎng)狀態(tài)下的細(xì)胞粘附率。

活死細(xì)胞染色是一種直觀地反映細(xì)胞活性的方法。在共聚焦顯微鏡下，50∶50支架上的PDLF 相對活性好，活細(xì)胞百分率高于其他兩組，提示50∶50支架對細(xì)胞活性的影響最小，所提供的細(xì)胞外環(huán)境最接近正常生理?xiàng)l件。

綜上所述，50∶50 支架組生物相容性最優(yōu)，說明50∶50是此復(fù)合支架中聚乳酸和聚己內(nèi)酯最佳的合成比例。同時，PDLF 能夠在靜電紡絲納米纖維上生長、增殖、粘附，并具有正常的細(xì)胞活性，此支架可作為牙周膜組織工程候選支架材料。

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