經(jīng)導(dǎo)管移植自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)豬急性心肌梗死后心功能的影響＊

孫海燕， 王顯良， 何 飛， 武惠敏， 劉迎春， 楊秀麗， 李 波， 趙國(guó)安△

1 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院心內(nèi)科，新鄉(xiāng) 453003

2 廈門(mén)市第二醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室，廈門(mén) 361021

3 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液透析室，衛(wèi)輝 453100

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是臨床上一種嚴(yán)重的缺血性心臟病（ischemic heart disease，IHD）。有功能心肌細(xì)胞數(shù)量的減少及繼發(fā)心肌重塑是心肌梗死后心力衰竭的主要原因。如何增加有功能心肌細(xì)胞的數(shù)量是目前心血管領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，而自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）因其諸多優(yōu)勢(shì)成為治療心肌梗死的熱點(diǎn)細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)制備豬急性心肌梗死模型，將自體MSCs經(jīng)導(dǎo)管注入至梗死區(qū)域相關(guān)冠狀動(dòng)脈，檢測(cè)心肌梗死前后心功能變化并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

巴馬香豬13 頭，雌雄不限（河南省農(nóng)科院提供），3～4月齡，體重18～25kg。隨機(jī)分為對(duì)照組和MSCs移植組。

VEGF ELISA 試劑盒、CD34、CD105（R＆D 公司）；Ⅷ因子兔抗人一抗、羊抗兔二抗、DAB 免疫組化顯色試劑盒（北京中山金橋生物技術(shù)公司）；特級(jí)胎牛血清（杭州四季青生物工程有限公司）。

1.2 自體MSCs的體外培養(yǎng)和鑒定

巴馬香豬肌注麻醉（氯胺酮15 mg／kg）后仰臥位固定，抽取骨髓20mL，采用Percoll液密度梯度分離［1－3］聯(lián)合貼壁培養(yǎng)法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，用免疫熒光法檢測(cè)第3 代細(xì)胞表面抗原CD34、CD105，鑒定MSCs。

1.3 心肌梗死模型的建立

豬用氯胺酮麻醉后固定于操作臺(tái)上，消毒、鋪巾，Seldinger法穿刺右股動(dòng)脈，置入6F 鞘管，經(jīng)鞘管給予肝素200 U／kg，6FJL4指引導(dǎo)管行左冠脈造影，BMW Universal指引導(dǎo)絲至冠狀動(dòng)脈左前降支（left anterior descending coronary artery，LAD）遠(yuǎn)端，2.0mm×15mm OTW 球囊送至前降支第2對(duì)角支以遠(yuǎn)，4atm 擴(kuò)張球囊，連續(xù)4 次，時(shí)間分別為30、60、120、300s，每次間隔30s，最后封堵前降支。造影顯示球囊遠(yuǎn)端血流完全中斷，持續(xù)30 min。記錄心電圖，并留取靜脈血行肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK－MB）檢查。

1.4 MSCs的移植

心肌梗死模型建立后即刻取經(jīng)4，6－二咪基－4－聯(lián)苯基吲哚（4，6－Diamidino－2－Phenylindole，DAPI）標(biāo)記的第3代MSCs懸液2mL，經(jīng)OTW 球囊注入移植組前降支，保留球囊2 min。對(duì)照組同法注入等體積的無(wú)血清DEME 培養(yǎng)液。術(shù)后繼續(xù)常規(guī)喂養(yǎng)4周。

1.5 心功能測(cè)定

對(duì)所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于制模前、制模后4周行超聲心動(dòng)圖檢查測(cè)量左室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end－systolic dimension，LVESD）、左室舒張末期內(nèi)徑 （left ventricular end－diastolic dimension，LVEDD）和左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricle ejection fraction，LVEF），測(cè)量3次取平均值。

1.6 心肌組織學(xué)及免疫組化檢測(cè)

1.6.1 心肌組織學(xué)檢查 移植4周后處死動(dòng)物，立即取心臟，冷PBS沖洗后稱(chēng)重，剪去左、右心房，右心室及脂肪組織，將左心室沿長(zhǎng)軸切成小塊，制成冰凍切片，采用2，3，4－三苯基氯化四氮唑（TTC）染色，用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)測(cè)量每片心室肌面積和梗死心肌面積。

1.6.2 血清VEGF 濃度檢測(cè) 在制模前、移植后即刻、移植后5、7、10d及4周時(shí)抽取全血，離心后取血清1.0 mL 用ELISA 試劑盒檢測(cè)血清中VEGF的濃度［4］。

1.6.3 毛細(xì)血管計(jì)數(shù) 組織切片經(jīng)Ⅷ因子標(biāo)記染色，把染色陽(yáng)性的內(nèi)皮細(xì)胞作為毛細(xì)血管計(jì)數(shù)。每只動(dòng)物隨機(jī)選取3張切片，每張切片選取5個(gè)放大400倍視野進(jìn)行觀察，計(jì)數(shù)毛細(xì)血管數(shù)目。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MSCs的形態(tài)學(xué)變化及鑒定

原代細(xì)胞在光鏡下呈圓形或類(lèi)圓形，大小不一，數(shù)目較多。多次換液后，細(xì)胞呈紡錘形或多邊形，部分可見(jiàn)雙核仁（圖1A）。7d后，細(xì)胞鋪滿(mǎn)瓶底，大部分細(xì)胞變?yōu)殚L(zhǎng)梭形，少部分呈多角形，細(xì)胞呈旋渦狀排列（圖1B）。傳代后鏡下細(xì)胞分散均勻、輻射狀平行排列，呈均一紡錘形，似成纖維細(xì)胞樣。細(xì)胞經(jīng)免疫熒光檢查，細(xì)胞表面未見(jiàn)紅色熒光，提示CD34陰性（圖2A），但可以見(jiàn)到綠色熒光，提示CD105陽(yáng)性（圖2B）。

2.2 心肌梗死模型制備前后心肌酶學(xué)的變化

13只豬接受心肌梗死模型制備，其中3只因室顫死亡。制模前、制模后6h兩組間心肌酶學(xué)（CK、CK－MB）比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與制模前心肌酶學(xué)相比，制模后6h兩組血清CK、CK－BM 均較制模前明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），見(jiàn)表1。

圖1 原代培養(yǎng)細(xì)胞（×200）Fig.1 Primary cell culture（×200）

圖2 細(xì)胞免疫熒光檢查（×400）Fig.2 Detection of immunofluorescence（×400）

表1 兩組動(dòng)物不同時(shí)間心肌酶的比較（±s，n＝5，U／L）Table 1 Cardiac enzymes of the two groups at different time points（±s，n＝5，U／L）

表1 兩組動(dòng)物不同時(shí)間心肌酶的比較（±s，n＝5，U／L）Table 1 Cardiac enzymes of the two groups at different time points（±s，n＝5，U／L）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs.before operation

Before op eration 6hafter op eration Groups CK CK－MB MSCs 631.80±28.44 9.51±0.36 1 943.50±112.40＊620.40±11.20 CK CK－MB＊＊Control 618.50±30.12 9.45±0.33 2 023.10±127.45＊613.50±10.30＊＊

2.3 兩組左室內(nèi)徑及心功能的變化

較制模前，MSCs移植后4周兩組LVEF 均明顯降低，LVEDD 和LVESD 均顯著增加（均P＜0.05）。MSCS移植組與對(duì)照組比較LVEF 顯著增加，LVEDD 和LVESD 均顯著減少（均P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 移植前后超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝5）Table 2 Echocardiography before and after MSCs transplantation（±s，n＝5）

表2 移植前后超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝5）Table 2 Echocardiography before and after MSCs transplantation（±s，n＝5）

＊P＜0.05 vs.before operation；▲P＜0.05 vs.control group

Control group MSCs group Parameters lantation LVEF（%）56.76±1.13 34.54±1.55＊57.46±2.02 40.96±0.78 Before operation 4weeks after transp lantation Before operation 4weeks after transp＊▲LVESD（mm）23.54±1.03 34.68±0.53＊22.81±1.28 29.28±1.61＊▲LVEDD（mm）35.16±1.34 48.78±1.89＊34.08±2.30 41.66±1.53＊▲

2.4 兩組心肌梗死面積的比較

移植后4 周，MSCs 移植組心肌梗死面積為（18.0±5.8）%，對(duì)照組的心肌梗死面積為（23.0±7.2）%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.5 兩組不同時(shí)間點(diǎn)血清VEGF含量的變化

術(shù)前兩組動(dòng)物的血清VEGF 含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，術(shù)后開(kāi)始升高，對(duì)照組術(shù)后第5天達(dá)高峰，而MSCs移植組從術(shù)后第5 天起VEGF 含量較對(duì)照組增加，術(shù)后第7～10天達(dá)高峰，術(shù)后4周仍高于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 不同時(shí)間點(diǎn)兩組動(dòng)物血清VEGF含量（±s，n＝5，pg／mL）Table 3 Serum VEGF levels of the two groups at different time points（±s，n＝5，pg／mL）

表3 不同時(shí)間點(diǎn)兩組動(dòng)物血清VEGF含量（±s，n＝5，pg／mL）Table 3 Serum VEGF levels of the two groups at different time points（±s，n＝5，pg／mL）

＊P＜0.05 vs.control group

Time points Control group MSCs group Before operation 508.20±9.73 509.60±16.27 After operation 585.60±6.43 592.80±11.19 5th day 715.60±8.65 907.20±26.25＊7th day 618.40±9.34 1246.00±62.29＊10th day 537.60±15.95 954.40±17.63＊4th week 505.40±11.22 595.60±30.44＊

2.6 兩組Ⅷ因子免疫組化染色及毛細(xì)血管密度的比較

在MSCs移植組梗死周邊區(qū)及梗死區(qū)可見(jiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞呈棕色的陽(yáng)性血管，在對(duì)照組中上述區(qū)域同樣可以觀察到有新生血管（圖3），但血管密度低于移植組［（50.5±3.8）／mm2vs.（103.6±4.4）／mm2，P＜0.05］。

圖3 移植后4周心?、蜃用庖呓M化染色及毛細(xì)血管計(jì)數(shù)（×400）Fig.3 Vessels counted by immunohistochemistry with factor Ⅷmonoclonal antibody at 4th week after transplantation（×400）

3 討論

研究表明，在缺血性心臟病引起的心力衰竭患者中，心肌的血液灌注及心肌細(xì)胞數(shù)量減少是影響心肌梗死后心臟功能的關(guān)鍵性因素［5－6］，故改善受損區(qū)域的血供，挽救功能受抑的心肌細(xì)胞，增加心肌細(xì)胞數(shù)量可恢復(fù)梗死后心臟功能。本實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心肌梗死區(qū)及梗死周邊毛細(xì)血管密度的差別，觀察到細(xì)胞移植組的血管較對(duì)照組增加，且部分微血管的管腔內(nèi)可見(jiàn)到有紅細(xì)胞存在，提示這些血管可能參與冠狀動(dòng)脈微循環(huán)的心肌灌注，從而改善心肌的血液灌注。VEGF是一種內(nèi)皮細(xì)胞的特異性有絲分裂原及肝素結(jié)合分子，作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，在體外可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，在體內(nèi)可誘導(dǎo)血管發(fā)生，激發(fā)Ⅶ因子的釋放，改變細(xì)胞外基質(zhì)使其更易于血管生長(zhǎng)，是促使血管生成的關(guān)鍵因子之一。本實(shí)驗(yàn)對(duì)VEGF水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果提示細(xì)胞移植組血清VEGF 水平明顯高于對(duì)照組。VEGF 還可以通過(guò)介導(dǎo)蛋白激酶B 磷酸化和內(nèi)皮一氧化氮合酶的合成延長(zhǎng)內(nèi)皮細(xì)胞的壽命，提高缺血組織的局部血流。VEGF同樣能抑制腫瘤壞死因子α、H2O2和缺氧等多種因素誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡［7］。既往研究［8］證明干細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中及移植后具有分泌作用，可分泌與細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)的細(xì)胞因子，但對(duì)照組同樣存在VEGF，可能心肌梗死后炎癥同樣會(huì)刺激細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。另外，Barry 等［9］用SH－2從人MSCs 中分離出相對(duì)分子量為92kD 的蛋白質(zhì)，經(jīng)純化分析證明該蛋白質(zhì)為Endeglin（CD 105）。越來(lái)越多的證據(jù)表明CD105在血管生成中有重要作用，因此將CD105作為新生血管形成的標(biāo)記［10］。本實(shí)驗(yàn)MSCs鑒定證明MSCs CD105陽(yáng)性，推測(cè)MSCs可以分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管新生，改善心肌血液供應(yīng)。

總之，急性心肌梗死后移植MSCs可能分泌一系列細(xì)胞因子，誘導(dǎo)血管新生，還可能分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，改善缺血區(qū)和梗死區(qū)血流灌注，改善心臟功能。

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