自噬活性改變對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力的影響＊

李 軍， 王 倩， 林小星， 李炳宗

蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院血液科，蘇州 215004

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）存在于多種組織中，是具有多向分化潛能的早期前體細(xì)胞，在適當(dāng)?shù)臈l件或者環(huán)境下可以分化為某種細(xì)胞［1］。MSCs的兩個(gè)重要的分化方向?yàn)楣羌?xì)胞和脂肪細(xì)胞，成骨分化和成脂分化之間存在動(dòng)態(tài)平衡［2］，眾多分子機(jī)制參與此平衡的維持，然而確切的機(jī)制目前并不明確。

自噬是廣泛存在于真核生物中的保守的代謝過(guò)程，在此過(guò)程中，胞內(nèi)成分被降解，形成自噬小體，后者與溶酶體相結(jié)合形成自噬溶酶體［3］。目前關(guān)于自噬研究最深入的是關(guān)于其在細(xì)胞的生存或者死亡中的作用［4］。近來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，自噬在細(xì)胞和生物體的發(fā)育和分化過(guò)程中起重要作用，最早關(guān)于自噬在哺乳動(dòng)物發(fā)育中的作用是在受精卵中觀察到自噬現(xiàn)象［5］。另有研究發(fā)現(xiàn)，自噬參與血細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨骼肌肉細(xì)胞、胰島β細(xì)胞、腎臟足細(xì)胞等多種終末分化細(xì)胞的發(fā)育和分化［6］。最近有研究證明自噬在干細(xì)胞分化中具有重要作用，如Zhao等［7］報(bào)道，自噬功能損害導(dǎo)致膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的分化障礙是膠質(zhì)瘤發(fā)病原因之一。而自噬在MSCs的多向分化過(guò)程中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究中我們探討骨髓MSCs的基礎(chǔ)自噬活性，以及自噬活性改變對(duì)其向成骨細(xì)胞分化潛能的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料

Real－time PCR 引物由上海生工生物工程公司合成；逆轉(zhuǎn)錄和PCR 試劑盒購(gòu)自大連TaKaRa公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、LC3 和Beclin 1 抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；兔抗人GAPDH 單克隆抗體和辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG 抗體購(gòu)自Abcam 公司；TrizolTMreagent核酸分離試劑盒、地塞米松、維生素C、單丹磺酰戊二胺（MDC）、DF－12和MCDB 培養(yǎng)液購(gòu)自Sigma 公司；胎牛血清、ITS、青霉素和鏈霉素均購(gòu)自Gibco公司；BD 公司FACS Vantage型流式細(xì)胞儀；Nikon TE 2000型熒光顯微鏡；Leica SP2 激光共聚焦顯微鏡；Bio－Rad icycler熒光實(shí)時(shí)定量PCR 儀。

1.2 MSCs的分離和培養(yǎng)

取截肢患者骨髓5～10mL，肝素抗凝。Ficoll－Paque分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，培養(yǎng)液為50% DF12、40% MCDB、10%胎牛血清、1×ITS、100U／mL 青霉素和100μg／mL 鏈霉素。置37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱，48h后去除懸液，每3～4d換液。細(xì)胞融合達(dá)80%時(shí)用0.125%胰蛋白酶和0.1%EDTA 按照1∶3消化傳代。取第3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 自噬激活劑雷帕霉素處理MSCs后成骨誘導(dǎo)分化

MSCs培養(yǎng)體系中加入不同濃度的自噬激活劑雷帕霉素（10、50、100nmol／L），48h后換為成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液（10%胎牛血清、0.1μmol／L 地塞米松、0.2mmol／L 抗壞血酸、10 mmol／Lβ甘油磷酸鈉、100U／mL 青霉素和100μg／mL 鏈霉素），2周后檢測(cè)自噬活性和成骨基因ALP 和Runx2表達(dá)，4周后Von Kossa染色法檢測(cè)鈣質(zhì)沉積程度。

1.4 免疫熒光激光共聚焦法檢測(cè)LC－3表達(dá)

PBS洗滌接種于多聚賴氨酸包被玻片上的MSCs，用－20℃預(yù)冷的甲醇固定10min；PBS洗滌后滴加1%BSA 封閉液封閉細(xì)胞；滴加LC3（1∶1 000稀釋）一抗孵育，4℃過(guò)夜；PBS洗滌后滴加二抗避光孵育，4℃，1h；PBS洗滌后滴加熒光封裱液封片；共聚焦顯微鏡下觀察并攝片。

1.5 MDC熒光染色檢測(cè)自噬囊泡

用含MDC（50μmmol／L）的培養(yǎng)液孵育接種于多聚賴氨酸包被玻片上的MSCs，37℃、5%CO2、10 min；PBS洗滌后，用紫外線激發(fā)，于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 Von Kossa染色

10%甲醛固定MSCs，1h后去離子水洗凈，加入2%硝酸銀溶液，37℃避光反應(yīng)30min。去離子水洗凈后曝光，光鏡下觀察并拍照。

1.7 實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)

Trizol regeant提取MSCs總RNA，將逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA 產(chǎn)物，以GAPDH 為管家基因，應(yīng)用嵌入熒光染料SYBR Green Ⅰ進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增。25μL擴(kuò)增體系中含ROX 0.5μL，2×Premix 12.5μL，上游和下游引物各1μL，模板cDNA 1 μL。擴(kuò)增條件為：95℃10s，95℃5s，60℃60s，40個(gè)循環(huán)。ALP引物為5′－ACCATTCCCACGT－CTTCACATTTG－3′（正義）和5′－AGACATTCTCTCGTTCACCGCC－3′（反義）；Runx2 引物為5′－CCCCACGACAACCGCACCAT－3′（正義）和5′－CACTCCGGCCCACAA ATC－3′（反義）；GAPDH的引物為5′－GTC TTCACCACCATGGAGAAGCT－3′（正義）和5′－CATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCA－3′（反義）。

1.8 Western blot檢測(cè)

MSCs經(jīng)預(yù)冷PBS洗滌后離心，按照每1×106個(gè)細(xì)胞加入60μL裂解液，超聲裂解細(xì)胞，提取總蛋白，BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。調(diào)整各組上樣量在20μg，SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后，50g／L 脫脂奶粉封閉，加入兔抗人LC3 抗體（1∶100）和GAPDH 抗體（1∶1 000）孵育過(guò)夜，加HRP標(biāo)記羊抗兔IgG（1∶5 000）孵育1h。洗膜后，用ECL顯色系統(tǒng)顯示相應(yīng)蛋白條帶，照相。利用Glyko BandScan分析軟件測(cè)定條帶吸光度后統(tǒng)計(jì)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 雷帕霉素促進(jìn)LC3－Ⅰ向LC3－Ⅱ轉(zhuǎn)化

雷帕霉素作為自噬激動(dòng)劑，可以明顯增加LC3－Ⅱ的表達(dá)量，并且此改變與雷帕霉素的劑量呈正比，見(jiàn)圖1。說(shuō)明雷帕霉素可以明顯增加MSCs的自噬活性。

圖1 雷帕霉素對(duì)MSCs的LC3表達(dá)的影響Fig.1 Effect of rapamycin on the expression of LC3in MSCs

2.2 雷帕霉素增加自噬囊泡數(shù)量

基礎(chǔ)狀態(tài)下MSCs自噬囊泡數(shù)量不多，但是隨著雷帕霉素濃度的升高，自噬囊泡數(shù)量明顯升高，見(jiàn)圖2。也說(shuō)明雷帕霉素能夠增加MSCs自噬活性。

圖2 雷帕霉素對(duì)MSCs自噬囊泡數(shù)量的影響（×200）Fig.2 Effect of rapamycin on the number of autophagic vacuoles in MSCs（×200）

2.3 雷帕霉素增加LC3數(shù)量

基礎(chǔ)狀態(tài)下MSCs胞質(zhì)中可見(jiàn)少量LC3，但是在雷帕霉素作用后，LC3 表達(dá)明顯增加，并呈劑量依賴性，見(jiàn)圖3。再次證明雷帕霉素可以增加MSCs自噬活性。

圖3 免疫熒光激光共聚焦法檢測(cè)MSCs經(jīng)不同濃度雷帕霉素處理后的LC－3表達(dá)（×200）Fig.3 Localization of LC3in MSCs after treatment with different concentrations of rapamycin detected by using immunocytochemistry（×200）

2.4 雷帕霉素減弱MSCs的成骨相關(guān)基因的表達(dá)

雷帕霉素處理后的MSCs其向成骨細(xì)胞分化的潛能降低，表現(xiàn)為成骨相關(guān)基因Runx2和ALP 的mRNA 表達(dá)在成骨培養(yǎng)2周后隨著雷帕霉素濃度的增加而減少，見(jiàn)圖4。

2.5 雷帕霉素減弱MSCs鈣質(zhì)沉積程度

不同濃度的雷帕霉素處理MSCs，4 周后Von Kossa染色檢測(cè)其鈣質(zhì)沉積，結(jié)果顯示雷帕霉素明顯減弱MSCs向成骨細(xì)胞分化的能力，此改變與雷帕霉素的劑量呈反比，見(jiàn)圖5。

圖4 實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)MSCs經(jīng)不同濃度雷帕霉素處理后的ALP和Runx2mRNA 表達(dá)Fig.4 mRNA expression of ALP and Runx2in MSCs after treatment with different concentrations of rapamycin

圖5 Von Kossa染色檢測(cè)經(jīng)不同濃度雷帕霉素處理后MSCs的鈣質(zhì)沉積程度（×100）Fig.5 Calcium deposit in MSCs after treatment with different concentrations of rapamycin（×100）

3 討論

基于MSCs具有向成骨細(xì)胞分化的功能，因而來(lái)源于各種組織的MSCs被作為骨組織工程的重要細(xì)胞來(lái)源［8］，而由于骨髓MSCs取材簡(jiǎn)單，來(lái)源豐富，所以成為主要細(xì)胞來(lái)源。近些年來(lái)，越來(lái)越多的研究對(duì)MSCs向成骨細(xì)胞分化的機(jī)制和影響因素進(jìn)行探討［8－9］，但是確切機(jī)制目前尚未完全明確。

MSCs向成骨細(xì)胞分化分為3個(gè)階段［10］，第一階段為細(xì)胞增殖期，而第二階段即第5～14 天為ALP 的轉(zhuǎn)錄和蛋白合成期，此后ALP 表達(dá)下降［11］，再后高表達(dá)骨鈣蛋白和骨橋蛋白，并逐漸形成鈣質(zhì)沉積［12］。而Runx2是成骨的最重要的轉(zhuǎn)錄因子［13－14］，所以我們?cè)诔晒桥囵B(yǎng)2周后檢測(cè)ALP和Runx2的表達(dá)，第4周檢測(cè)鈣質(zhì)沉積程度。無(wú)論是成骨基因檢測(cè)還是鈣質(zhì)沉積檢測(cè)均提示作為自噬激活劑的雷帕霉素能夠減弱MSCs向成骨細(xì)胞分化的能力。

MSCs的自噬活性改變可能受到其周?chē)?xì)胞影響，Sanchez等［15］報(bào)道，利用去血清培養(yǎng)MSCs與MCF－7乳腺癌細(xì)胞共培養(yǎng)，模擬腫瘤組織核心缺氧環(huán)境下MSCs對(duì)腫瘤細(xì)胞的支持作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MSCs的自噬活性明顯升高，提示MSCs通過(guò)自噬來(lái)維持自身生存，同時(shí)對(duì)周?chē)[瘤細(xì)胞產(chǎn)生支持作用。此發(fā)現(xiàn)與我們?cè)诙喟l(fā)性骨髓瘤中的研究相符［16］，我們發(fā)現(xiàn)正常骨髓MSCs本身存在一定基礎(chǔ)的自噬活性，而多發(fā)性骨髓瘤患者的骨髓MSCs自噬活性明顯增加，所以MSCs是否在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的影響下自噬活性升高值得進(jìn)一步探討。

近些年來(lái)，自噬作為生物體內(nèi)保守的生命現(xiàn)象，在細(xì)胞和器官的分化和發(fā)育過(guò)程中的作用備受關(guān)注。最初的相關(guān)資料主要見(jiàn)于神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)研究中，自噬缺乏導(dǎo)致大腦和小腦皮質(zhì)廣泛的神經(jīng)元缺失和神經(jīng)退行性病變［17］。目前發(fā)現(xiàn)，自噬功能損傷抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的分化［7］。Nakai等［18］研究發(fā)現(xiàn)，自噬對(duì)于心肌細(xì)胞的發(fā)育至關(guān)重要，自噬的缺失可能導(dǎo)致心肌肥厚、心臟擴(kuò)大以及心功能不全。自噬對(duì)于胰腺β細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能的維持至關(guān)重要，自噬活性缺陷導(dǎo)致血糖明顯升高［19］。肌肉纖維組織的結(jié)構(gòu)和功能完整以及脂肪細(xì)胞分化和發(fā)育也和自噬關(guān)系密切［20－21］。自噬是造血細(xì)胞分化成熟過(guò)程中的重要過(guò)程，抑制自噬可能導(dǎo)致造血細(xì)胞的分化成熟障礙，表現(xiàn)為貧血和白細(xì)胞減少［22］。最近研究發(fā)現(xiàn)，自噬參與了慢性粒細(xì)胞性白血病K562細(xì)胞向巨核細(xì)胞的分化過(guò)程［23］。同時(shí)，自噬還與細(xì)胞凋亡有關(guān)［24－26］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)利用自噬激動(dòng)劑雷帕霉素促進(jìn)MSCs的自噬活性后，其向成骨細(xì)胞分化的潛力減弱，說(shuō)明MSCs的自噬活性與其向成骨細(xì)胞分化潛能之間存在密切聯(lián)系。

綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)自噬激活劑雷帕霉素可以增加骨髓MSCs的自噬活性，同時(shí)抑制其向成骨細(xì)胞分化中，初步證實(shí)自噬活性改變可能參與了MSCs向成骨細(xì)胞的分化過(guò)程。

［1］ Uccelli A，Moretta L，Pistoia V.Mesenchymal stem cells in health and disease［J］.Nat Rev Immunol，2008，8（9）：726－736.

［2］ Hong J H，Hwang E S，McManus M T，et al.TAZ，a transcriptional modulator of mesenchymal stem cell differentiation［J］.Science，2005，309（5737）：1074－1078.

［3］ Mehrpour M，Esclatine A，Beau I，et al.Overview of macroautophagy regulation in mammalian cells［J］.Cell Res，2010，20（7）：748－762.

［4］ Eisenberg－Lerner A，Bialik S，Simon H U，et al.Life and death partners：apoptosis，autophagy and the cross－talk between them［J］.Cell Death Differ，2009，16（7）：966－975.

［5］ Tsukamoto S，Kuma A，Murakami M，et al.Autophagy is essential for preimplantation development of mouse embryos［J］.Science，2008，321（5885）：117－120.

［6］ Mizushima N，Levine B.Autophagy in mammalian development and differentiation［J］.Nat Cell Biol，2010，12（9）：823－830.

［7］ Zhao Y，Huang Q，Yang J，et al.Autophagy impairment inhibits differentiation of glioma stem／progenitor cells ［J］.Brain Res，2010，1313：250－258.

［8］ Park B W，Kang E J，Byun J H，et al.In vitro and in vivo osteogenesis of human mesenchymal stem cells derived from skin，bone marrow and dental follicle tissues［J］.Differentiation，2012，83（5）：249－259.

［9］ Zomorodian E，Baghaban Eslaminejad M.Mesenchymal stem cells as a potent cell source for bone regeneration［J］.Stem Cells Int，2012，2012：980353.

［10］ Huang Z，Nelson E R，Smith R L，et al.The sequential expression profiles of growth factors from osteoprogenitors［correction of osteroprogenitors］to osteoblasts in vitro［J］.Tissue Eng，2007，13（9）：2311－2320.

［11］ Aubin J E.Regulation of osteoblast formation and function［J］.Rev Endocr Metab Disord，2001，2（1）：81－94.

［12］ Rawadi G，Vayssiere B，Dunn F，et al.BMP－2controls alkaline phosphatase expression and osteoblast mineralization by a Wnt autocrine loop［J］.J Bone Miner Res，2003，18（10）：1842－1853.

［13］ Ueta C，Iwamoto M，Kanatani N，et al.Skeletal malformations caused by overexpression of Cbfa1or its dominant negative form in chondrocytes［J］.J Cell Biol，2001，153（1）：87－100.

［14］ Ducy P，Zhang R，Geoffroy V，et al.Osf2／Cbfa1：a transcriptional activator of osteoblast differentiation［J］.Cell，1997，89（5）：747－754.

［15］ Sanchez C G，Penfornis P，Oskowitz A Z，et al.Activation of autophagy in mesenchymal stem cells provides tumor stromal support［J］.Carcinogenesis，2011，32（7）：964－972.

［16］ 李軍，李炳宗，陳萍，等.硼替佐米對(duì)多發(fā)性骨髓瘤患者間充質(zhì)干細(xì)胞自噬活性和成骨分化潛能的影響［J］.中華內(nèi)科雜志，2012，51（2）：140－141.

［17］ Hara T，Nakamura K，Matsui M，et al.Suppression of basal autophagy in neural cells causes neurodegenerative disease in mice［J］.Nature，2006，441（7095）：885－889.

［18］ Nakai A，Yamaguchi O，Takeda T，et al.The role of autophagy in cardiomyocytes in the basal state and in response to hemodynamic stress［J］.Nat Med，2007，13（5）：619－624.

［19］ Jung H S，Lee M S.Role of autophagy in diabetes and mitochondria［J］.Ann N Y Acad Sci，2010，1201：79－83.

［20］ Masiero E，Agatea L，Mammucari C，et al.Autophagy is required to maintain muscle mass［J］.Cell Metab，2009，10（6）：507－515.

［21］ Singh R，Xiang Y，Wang Y，et al.Autophagy regulates adipose mass and differentiation in mice［J］.J Clin Invest，2009，119（11）：3329－3339.

［22］ Mortensen M，F(xiàn)erguson D J，Edelmann M，et al.Loss of autophagy in erythroid cells leads to defective removal of mitochondria and severe anemia in vivo［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2010，107（2）：832－837.

［23］ Colosetti P，Puissant A，Robert G，et al.Autophagy is an important event for megakaryocytic differentiation of the chronic myelogenous leukemia K562 cell line ［J］.Autophagy，2009，5（8）：1092－1098.

［24］ 石亮，李一榮，胡麗華.自身免疫調(diào)節(jié)因子促進(jìn)THP－1細(xì)胞的自噬性凋亡［J］.華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2010，39（4）：461－465.

［25］ 張志才，邵增務(wù)，熊蠡茗，等.順鉑誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞自噬及其與凋亡關(guān)系的體外研究［J］.華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2011，40（2）：178－182.

［26］ 鄒燕梅，熊華，于世英，等.乏氧誘導(dǎo)的自噬與肺腺癌放射抵抗的相關(guān)性研究［J］.華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2011，40（4）：413－416.