LRIG1過表達對順鉑誘導的膠質瘤細胞凋亡的影響及其機制＊

肖群根， 張 濤， 毛 峰， 王 瑩， 謝蕊繁， 王寶峰， 郭東生， 雷 霆

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院神經外科，武漢 430030

順鉑（cisplatin，CDDP）是廣泛應用于治療包括膠質瘤在內的多種惡性腫瘤的化療藥物［1］。雖然其在腫瘤化療中的地位尤為重要，但是還有許多腫瘤對CDDP的治療不敏感［2］，目前越來越多的研究集中在如何提高腫瘤對化療藥物治療的敏感性?；煹挚雇ǔＥc酪氨酸激酶受體（receptor tyrosine kinases，RTKs）的過度表達或異常激活有關，這些RTKs受體（如EGFR）激活后促進細胞增殖與存活［3］。LRIG1 基因是LRIG 基因家族（LRIG1、LRIG2和LRIG3）中的一員，目前已證實其可負性調節(jié)EGFR 信號通路而發(fā)揮抑癌基因作用［4］，但其是否能改善膠質瘤對化療藥物的敏感性尚未見報道。本研究將LRIG1 基因轉染入膠質瘤細胞U251，探討LRIG1過表達后對CDDP 誘導的膠質瘤細胞凋亡的影響及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

膠質瘤細胞系U251購自中國上海細胞保藏中心，LRIG1 過表達質粒（pEGFP－LRIG1）由瑞典Hakan Hedman教授饋贈。Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司），G418（美國Amresco公司），RPE／7－AAD 雙染細胞凋亡檢測試劑盒（美國Southern Biotech 公司），EGFR、P－EGFR（美國Upstate公司），Bcl－2、Bax、Caspase－3（美國CST 公司），ReverTra Ace－α－逆轉錄試劑盒、SYBR Green Realtime PCR 試劑盒（日本TOYOBO 公司）。

1.2 細胞轉染

U251細胞種于24孔板內，待細胞長至80%融合時按照Lipofectamine 2000 轉染說明書進行轉染，將對照質粒（EGFP－N1）及LRIG1質粒（EGFPN1－LRIG1）分別轉染U251 細胞。用600 mg／L G418對細胞進行篩選，挑取細胞克隆，逐級擴大培養(yǎng)。

1.3 Real－time PCR

分別提取對照組及LRIG1過表達組細胞mRNA，并逆轉錄成cDNA，Real－time PCR反應條件如下：95℃，1min，以后每個循環(huán)為95℃15s，60℃30 s，72℃45s，循環(huán)40次。LRIG1real－time PCR 引物［5］正義鏈：5′－GGTGAGCCTGGCCTTATGTGAATA－3′，反義鏈：5′－CACCACCATCCTGCACCTCC－3′。GAPDH 引物正義鏈：5′－CACCAGGGCTGCTTTTAACTCTGGTA－3′，反義鏈：5′－CCTTGACGGTGCCATGGAATTTGC－3′。以GAPDH 為內參，通過2－ΔΔCt方法進行相對定量分析。

1.4 R－PE／7－AAD雙染細胞凋亡檢測

細胞同步化培養(yǎng)24h 后加入含有不同濃度CDDP的完全培養(yǎng)液再培養(yǎng)48h，收集細胞，按RPE／7－AAD 凋亡試劑盒說明書進行染色，細胞用預冷的PBS洗2遍后用500μL 緩沖液重懸細胞，再加入10μL Annexin Ⅴ－R－PE 于冰上孵育15min，最后加入10μL 7－AAD，混勻后于流式細胞分析儀上檢測凋亡，實驗行3次，結果取3次平均值。

1.5 Western blot檢測蛋白表達

將細胞用無血清培養(yǎng)液同步化培養(yǎng)24h后再用含有不同濃度CDDP的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)48h，收集細胞，PBS洗細胞2遍后，RIPA 裂解液冰上裂解細胞，離心后收集上清，用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白轉移到醋酸纖維膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST 常溫封閉1h，加入一抗（均為1∶1 000）4℃孵育過夜；TBST 洗滌3次，每次10min，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，37℃孵育1h；增強化學發(fā)光顯色。條帶密度由Quantity one軟件分析。

1.6 統(tǒng)計分析

2 結果

2.1 U251過表達LRIG1穩(wěn)定株的鑒定

Real－time PCR 檢測結果示LRIG1 過表達組（U251－LRIG1）LRIG1 mRNA 表達水平是對照組（U251－EGFP）的（26.90±1.85）倍（P＜0.01）。Western blot檢測結果示LRIG1 過表達組LRIG1蛋白表達水平較對照組也明顯升高（圖1）。過表達LRIG1的膠質瘤細胞U251穩(wěn)定株成功建立。

圖1 LRIG1過表達U251細胞中LRIG1mRNA 及蛋白的表達Fig.1 The expression levels of LRIG1mRNA and proteins

2.2 LRIG1對CDDP誘導的膠質瘤細胞凋亡的影響

在濃度為0、10、20μg／mL 的CDDP 作用下，LRIG1過表達組及對照組的細胞凋亡率分別為（3.66±0.51）%和（1.49±0.27）%，（16.35±0.89）%和（7.60±0.50）%，（29.63±2.12）%和（10.87±1.82）%。提示在不同濃度的CDDP誘導下，LRIG1過表達組細胞凋亡率均明顯高于對照組（P＜0.01）（圖2）。

圖2 LRIG1對CDDP誘導的膠質瘤細胞凋亡的影響Fig.2 The effects of LRIG1on apoptosis of glioma cells induced by CDDP

2.3 CDDP誘導膠質瘤細胞EGFR 活化

不同濃度的CDDP（0、5、10、20μg／mL）作用48 h，隨著CDDP 濃度的增加，EGFR 蛋白表達下降，其活化形式P－EGFR 的表達則升高；條帶相對密度分析示，各濃度組間EGFR 及P－EGFR 表達量的差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。提示CDDP可誘導膠質瘤細胞EGFR 活化，且這種活化與CDDP呈劑量依賴性（圖3）。

圖3 CDDP誘導膠質瘤細胞U251EGFR 活化Fig.3 CDDP－induced activation of EGFR in U251cells

2.4 LRIG1對CDDP誘導的膠質瘤細胞P－EGFR及凋亡相關蛋白表達的影響

濃度分別為0、10及20μg／mL CDDP作用下，LRIG1過表達組P－EGFR 水平較對照組均明顯降低；LRIG1 過表達組促凋亡相關蛋白Bax 及Caspase－3表達水平較對照組明顯升高，凋亡抑制相關蛋白Bcl－2則明顯降低（圖4）。

圖4 LRIG1對CDDP誘導的膠質瘤細胞P－EGFR及凋亡相關蛋白表達的影響Fig.4 The effects of LRIG1on the expression of P－EGFR and apoptosis－related proteins induced by CDDP

3 討論

惡性膠質瘤是中樞神經系統(tǒng)最常見的腫瘤，對于膠質母細胞腫瘤，經過手術、放療和化療等綜合治療后，患者的中位生存期也只有12～15個月［6］?；熢谀z質瘤的綜合治療中占有重要地位，然而其嚴重的副作用及腫瘤對化療藥物的抵抗性使其臨床應用嚴重受限，探討腫瘤對化療藥物產生抵抗性的機制及改善腫瘤對化療藥物的敏感性已成為新的挑戰(zhàn)。

CDDP是治療多種惡性腫瘤包括膠質瘤的最常用和最有效的化療藥物之一［1］。在化療抵抗的分子水平研究中，EGFR 最受關注。目前已有研究發(fā)現，在多種實體腫瘤中CDDP 的耐藥性與EGFR 表達增強密切相關［7－8］。本研究發(fā)現，在膠質瘤細胞系U251中，CDDP可誘導膠質瘤細胞EGFR 活化，且隨著CDDP濃度增加，P－EGFR 表達也增加，CDDP誘導膠質瘤細胞EGFR 活化呈劑量依賴性。

LRIG1是最早發(fā)現的LRIG 基因家族成員，目前已證實其可負性調節(jié)EGFR 信號通路而發(fā)揮抑癌基因作用［9－10］。本研究建立穩(wěn)定表達LRIG1 的膠質瘤細胞株U251，發(fā)現在不同CDDP 濃度作用下，LRIG1過表達組細胞凋亡率均明顯高于對照組，LRIG1過表達組細胞P－EGFR 表達明顯下降，抗凋亡相關蛋白Bcl－2 明顯下降，凋亡相關蛋白Bax、Caspase－3 升高，證實LRIG1 可通過下調PEGFR 水平改善膠質瘤對化療藥CDDP 的敏感性。結合LRIG1對EGFR 的負反饋機制，推測LRIG1改善膠質瘤對化療藥CDDP敏感性的具體機制為：CDDP誘導膠質瘤細胞EGFR 活化，EGFR 激活后誘導LRIG1蛋白合成，LRIG1轉移至細胞膜，在胞外通過LRR 區(qū)與EGFR 結合，胞內段通過E3泛素連接酶c－Cb1與EGFR 形成復合體，使EGFR 泛素化，內吞，最后降解，抑制EGFR 信號通路，從而改善細胞對CDDP的敏感性［9，11］。

綜上所述，膠質瘤對化療藥物CDDP的耐藥性可能與CDDP 誘導EGFR 活化有關，而LRIG1 通過抑制EGFR 的活化而明顯改善膠質瘤細胞對CDDP的敏感性，LRIG1在膠質瘤化療藥物的研究方面具有廣闊的應用前景。

［1］ Duan L，Aoyagi M，Tamaki M，et al.Sensitization of human malignant glioma cell lines to tumor necrosis factor－induced apoptosis by cisplatin［J］.J Neurooncol，2001，52（1）：23－36.

［2］ Brozovic A，Ambriovic－Ristov A，Osmak M.The relationship between cisplatin－induced reactive oxygen species，glutathione，and BCL－2and resistance to cisplatin［J］.Crit Rev Toxicol，2010，40（4）：347－359.

［3］ Xu A M，Huang P H.Receptor tyrosine kinase coactivation networks in cancer［J］.Cancer Res，2010，70（10）：3857－3860.

［4］ Hedman H，Henriksson R.LRIG inhibitors of growth factor signalling－double－edged swords in human cancer？［J］.Eur J Cancer，2007，43（4）：676－682.

［5］ Nilsson J，Vallbo C，Guo D，et al.Cloning，characterization，and expression of human LIG1［J］.Biochem Biophys Res Commun，2001，284（5）：1155－1161.

［6］ Mao H，Lebrun D G，Yang J，et al.Deregulated signaling pathways in glioblastoma multiforme：molecular mechanisms and therapeutic targets［J］.Cancer Invest，2012，30（1）：48－56.

［7］ Dai Q，Ling Y H，Lia M，et al.Enhanced sensitivity to the HER1／epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor erlotinib hydrochloride in chemotherapy－resistant tumor cell lines［J］.Clin Cancer Res，2005，11（4）：1572－1578.

［8］ Kuroda H，Takeno M，Murakami S，et al.Inhibition of heme oxygenase－1with an epidermal growth factor receptor inhibitor and cisplatin decreases proliferation of lung cancer A549 cells［J］.Lung Cancer，2010，67（1）：31－36.

［9］ Gur G，Rubin C，Katz M，et al.LRIG1restricts growth factor signaling by enhancing receptor ubiquitylation and degradation［J］.EMBO J，2004，23（16）：3270－3281.

［10］ 葉飛，高慶蕾，徐同江，等.LRIG1對膠質瘤細胞中表皮生長因子受體的抑制作用及其機制［J］.華中科技大學學報：醫(yī)學版，2009，38（1）：49－51.

［11］ Benhar M，Engelberg D，Levitzki A.Cisplatin－induced activation of the EGF receptor［J］.Oncogene，2002，21（57）：8723－8731.