21 - 清咽滴丸抗柯薩奇病毒CVB3 ，CVB5 作用的研究*

王小龍，陳 霞，遲 瑋，褚玉晶，李志媛，李曉眠

(天津醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室，天津 300070)

清咽滴丸為新型主治咽炎中藥合劑，具有疏風清熱，解毒利咽，消腫止痛的功效［1］，臨床效果顯著。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，清咽滴丸有很強的抑菌殺菌作用，尤其是對白色念球菌和金黃色葡萄球菌［2］?？滤_奇病毒B3、B5(Coxsackie virus B3，B5;CVB3，CVB5)已證明是小兒病毒性心肌炎、無菌性腦炎、新生兒全身感染、流行性胸痛等疾病的主要病原體，目前尚無特效藥治療或預(yù)防。本試驗對清咽滴丸及其六種成分抗柯薩奇病毒作用進行了初步試驗研究，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 清咽滴丸(天津市中新藥業(yè)集團股份有限公司第六中藥廠提供);甘草、青黛、冰片、訶子、牛黃、薄荷(天津市中新藥業(yè)集團股份有限公司第六中藥廠提供);病毒靈(山西太原藥業(yè)有限公司生產(chǎn))。

1.1.2 細胞與病毒株 Vero 細胞株;柯薩奇B3病毒Nancy 株;柯薩奇B5病毒Kauchker 株(天津醫(yī)科大學(xué)微生物教研室提供)。

1.1.3 實驗動物 雄性健康SD 大鼠18 只，體重均約250 g，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)實驗動物中心。

1.1.4 試劑與耗材 RPMI-1640 培養(yǎng)基(Gibco);胎牛血清(Hyclone);四甲基偶氮唑藍(MTT)(Sigma);二甲基亞砜(天津大學(xué)科威公司);96 孔培養(yǎng)板(Costar)。

1.1.5 儀器與設(shè)備 CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Forma，3111 型);倒置顯微鏡(德國Zeiss，Axiorert 200);酶標儀(Multiskan Mk3，Thermo Labsystems)。

1.2 方法

1.2.1 藥物溶解與稀釋 0.8 g 甘草、青黛、訶子、牛黃、病毒靈分別溶解于3.5 ml 1640 培養(yǎng)液后加入0.5 ml DMSO;0.8 g 冰片、薄荷分別溶解于0.5 ml DMSO后加入3.5 ml 1640 培養(yǎng)液。充分溶解后，1 500 r/min離心5 min，棄不溶殘渣，高壓滅菌。將無菌的藥液先稀釋10 倍后再做連續(xù)2 倍的遞次稀釋，配制藥液濃度為:2. 0 ×10-2、1. 0 ×10-2、5 ×10-3、2. 5 × 10-3、1.25 ×10-3、6.25 ×10-4、3.125 ×10-4和1.56 ×10-4g/ml。

1.2.2 藥物毒性實驗 將Vero 細胞接種于96 孔板，100 μl /孔。分別加入上述各種濃度藥物的稀釋液，每個濃度4 復(fù)孔。另設(shè)正常細胞對照組、空白對照組。每日記錄CPE［3］，72 h 后用MTT 法檢測細胞存活率。細胞存活率(%)=(實驗組平均OD 值-空白對照組平均OD 值)/(正常細胞對照組平均OD 值-空白對照組平均OD 值)×100%。

1.2.3 病毒滴度TCID50的測定 將Vero 細胞接種于96 孔板，將柯薩奇B3、B5病毒連續(xù)10 倍的遞次稀釋，稀釋度為10-1～10-10。每孔接種10 μl 上述系列稀釋度的病毒液，于37 ℃吸附2 h 后換維持液繼續(xù)培養(yǎng)，每個濃度4 復(fù)孔。每日觀察CPE，待細胞病變不再繼續(xù)，按Reed-Muench 方法計算CVB3、CVB5的50%組織感染劑量(TCID50)。

1.2.4 藥物對病毒的作用 配制藥物無毒臨界濃度TC0，加入病毒侵染的細胞中，每藥物4 復(fù)孔。觀察CPE，待病毒對照孔細胞病變達75%以上，記錄各孔的CPE，MTT 法測病毒抑制率。病毒抑制率=(實驗組平均OD 值-病毒對照組平均OD 值)/(正常細胞組平均OD 值-病毒對照組平均OD 值)×100%。

1.2.5 不同濃度含藥血清對細胞毒性作用 取9 只大鼠隨機分成3 組，每組3 只。將清咽滴丸、甘草、訶子按100 mg/kg 體重的藥量給SD 大鼠灌胃(相當于成人臨床推薦劑量的6 倍)［4］，給藥前禁食12 h。給藥后1 h 內(nèi)眥取血，1 500 r/min 離心20 min，無菌分離血清，56 ℃水浴30 min 滅活［5］。將9 組含藥血清稀釋1∶ 2、1∶ 4、1∶ 6、1∶ 10、1∶ 16，100 μl/孔加到Vero 細胞中，每濃度4 復(fù)孔。每日觀察細胞的生長情況，48 h后用MTT 法測細胞存活情況。

1.2.6 不同時間含藥血清對病毒的抑制作用 取9只大鼠隨機分成3 組，每組3 只。將清咽滴丸、甘草、訶子按100 mg/kg 體重的藥量給SD 大鼠灌胃(相當于成人臨床推薦劑量的6 倍)，給藥前禁食12 h。灌胃前第1 次內(nèi)眥取血，灌胃25 min 之后，第2 次取血，以后每隔20 min 取血1 次，每次取血約1.5 ml?？偣膊裳? 次。無菌分離血清之后，將9 組血清按100 μl/孔加入到被病毒感染的單層Vero 細胞中，每組設(shè)4 復(fù)孔，每日記錄CPE。48 h 后用MTT 法測細胞存活情況。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用統(tǒng)計軟件SPSS 11.5 對數(shù)據(jù)進行ANOVA 單因素方差分析，各組間兩兩比較采用Dunnett 檢驗。

2 結(jié)果

2.1 清咽滴丸及其六種成分對細胞毒性作用 薄荷對細胞的毒性表現(xiàn)在使細胞先變細長呈梭形，繼而變小變圓。清咽滴丸、甘草、青黛、訶子、牛黃、冰片、病毒靈直接使細胞變小變圓。高濃度時細胞固縮破碎死亡量增大明顯。各藥物無毒臨界濃度(TC0):甘草為2.5 ×10-3g/ml，青黛為3. 125 × 10-4g/ml，冰片為2.5 ×10-3g/ml，牛黃為1. 56 × 10-4g/ml，訶子為3.125 ×10-4g/ml，薄荷為6.25 ×10-4g/ml，病毒靈為6.25 ×10-4g/ml。

2.2病毒滴度CVB3:TCID50= 10-7.6，CVB5:TCID50=10-7.2

2.3 藥物對病毒的作用 病毒對照組CPE 現(xiàn)象明顯，清咽滴丸、甘草、訶子組細胞病變明顯減弱，說明清咽滴丸、甘草、訶子對CVB3、CVB5感染的細胞有治療作用。其他組CPE 達75%以上，說明其他藥物無效。在CVB3感染的細胞實驗中，清咽滴丸組與病毒靈對照組差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，甘草組與病毒靈對照組差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，說明清咽滴丸、甘草對CVB3感染的細胞治療效果優(yōu)于病毒靈。訶子組與病毒靈對照組差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)，說明訶子對CVB3感染的細胞治療效果不優(yōu)于病毒靈。在CVB5感染的細胞實驗中，清咽滴丸組、甘草組、訶子組與病毒靈對照組差別均有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，說明清咽滴丸、甘草、訶子對CVB5感染的細胞治療效果優(yōu)于病毒靈。見表1。

表1 不同藥物對CVB3 和CVB5 的OD 值和抑制率

2.4 不同濃度含藥血清對細胞毒性作用 稀釋度為1∶ 10含清咽滴丸血清組、1∶ 10含甘草血清組、1 ∶ 6含訶子血清組均與病毒對照組CPE 有明顯差別，表現(xiàn)為對細胞的保護作用，且此時血清的毒性作用小。

2.5 不同時間含藥血清對病毒的抑制作用 將含藥血清分別對CVB3和CVB5的抑制率繪制成時間-效應(yīng)曲線，提示含藥血清對CVB3、CVB5的抑制作用具有明顯的時間依賴性，即清咽滴丸在65 min 時對CVB3，在65 min 至105 min 對CVB5有明顯抑制作用。而甘草在65 min 時，訶子在85 min 時分別對CVB3有明顯抑制作用。甘草在65 min，訶子在85min 時對CVB5有抑制作用但效果并不明顯見圖1 -3。

圖1 不同時刻含清咽滴丸血清對CVB3 和CVB5 的抑制率

圖2 不同時刻含甘草血清對CVB3 和CVB5 的抑制率

圖3 不同時刻含訶子血清對CVB3 和CVB5 的抑制率

3 討論

柯薩奇病毒B3、B5是正鏈RNA 病毒，主要通過糞-口途徑傳播，也可通過呼吸道或眼部黏膜感染。研究發(fā)現(xiàn)，約50%病毒性心肌炎系CVB3所致［6］。CVB5可以引起病毒性肝炎，持續(xù)感染可誘發(fā)肝硬化、肝癌。藥理學(xué)研究表明，清咽滴丸具有抗菌的作用。實驗證實甘草具有腎上腺皮質(zhì)激素作用，可抗病毒、消炎、抗變態(tài)反應(yīng)?？共《镜闹饕钚猿煞譃楦什萏鹚睾透什荻嗵?，既可直接清除病毒顆粒，又可誘生干擾素，增加自然殺傷細胞活性，從而使組織細胞得到保護。訶子果實水煎液有殺菌效用［7］。

在實驗研究中，采用了血清藥理學(xué)方法［8］，因為中藥粗制劑含有大量的雜質(zhì)，如直接應(yīng)用它進行體外實驗，這些雜質(zhì)會干擾實驗過程，影響實驗結(jié)果的科學(xué)性。因此，目前中藥藥理學(xué)研究中，有相當一部分中藥藥理活性實驗和作用機理研究是用血清藥理學(xué)進行的。同時，也應(yīng)該看到，血清藥理學(xué)作為一種年輕的實驗研究方法還不夠完善，存在著許多尚待解決的問題，如目前由于血清中有效成分的定量分析檢測尚未有突破性進展，因此還沒有關(guān)于不同狀態(tài)血清中有效成分的藥代動力學(xué)的研究比較。

本實驗提示了甘草和訶子是清咽滴丸抗CVB3、CVB5的有效成分，為甘草和訶子作為抗病毒感染藥物進行進一步開發(fā)研究提供了科學(xué)的理論依據(jù)，但甘草和訶子抗病毒的機制不明，有待更加深入的研究，其成分還需通過化學(xué)分析進一步明確其單體構(gòu)成，其抗CVB3、CVB5的作用還需要在動物體內(nèi)試驗上進一步加以證實。

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3 王亞峰，張美英，郝靜，等.苦丁茶水提物體外抗柯薩奇病毒B3活性的實驗研究.中華中醫(yī)藥雜志，2008，23(11):976

4 章元沛. 藥理學(xué)實驗. 第2 版. 北京:人民衛(wèi)生出版社，1996:238 -238

5 劉成海，劉平，劉成，等.抗肝纖維化有效中藥復(fù)方血清藥理學(xué)方法探討.中國實驗方劑學(xué)雜志，1998，4(2):16

6 Selinka H C，Wolde A，Sauter M，et al. Virus - receptor interactions of coxsackie B viruses and their putative influence on cardiotropism. Med Microbiol Immunol，2004，193(2 -3):127

7 蔡小華，謝兵，杜海軍.訶子化學(xué)成分及藥理作用的研究進展.藥學(xué)進展，2008，32(5):212

8 崔曉蘭，賀玉琢，高英杰，等.中藥復(fù)方血清藥理研究方法學(xué)探討. 中國實驗方劑學(xué)，1998，4(2):13