手機(jī)微波輻射對豚鼠耳蝸外毛細(xì)胞膜電位的影響△

馮曉華 龍孝斌 汪建 陳勇挺

目前，手機(jī)通訊已成為人們信息交流的主要工具之一，其電磁微波輻射可能對人們的健康構(gòu)成潛在的威脅。近年來，手機(jī)微波輻射對大腦及中樞神經(jīng)系統(tǒng)可能產(chǎn)生的影響備受研究者關(guān)注［1］。本研究擬通過建立模擬手機(jī)微波輻射豚鼠模型，分離豚鼠單個活的耳蝸外毛細(xì)胞（outer hair cell，OHC），在2 000Hz不同強(qiáng)度的純音刺激下，觀察單個離體豚鼠耳蝸OHC膜電位的變化及規(guī)律，探討手機(jī)微波輻射對聽覺功能可能產(chǎn)生的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選用成年健康雜色豚鼠20只，體重280～350g，雌雄不分，耳廓反射正常，由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。豚鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)10天后，隨機(jī)分為對照組、輻射組，每組各10只。

1.2 檢測儀器 ACAS 570 粘附式細(xì)胞儀（美國Meridian公司生產(chǎn)）；丹麥產(chǎn)Madson純音測聽儀；DIBAC4（3）熒光探針（美國Sigma公司產(chǎn)品，細(xì)胞膜特異性熒光探針）。

1.3 手機(jī)微波輻射裝置及輻射方法 手機(jī)通信頻率為900 MHz，功率密度為0.05 mW／cm2。將輻射組豚鼠限制于自制的籠中，將手機(jī)聽筒放置于豚鼠的耳部，距離豚鼠耳廓2cm，以便及時調(diào)整并模擬人通話的狀態(tài)。接通手機(jī)后輻射時間分別為1、6、12、24和48h（各2只豚鼠），對照組豚鼠除不進(jìn)行手機(jī)輻射外，其余處理均與輻射組相同。

1.4 實驗溶液的配制

1.4.1 Hepes 液的配制（mmol／L） NaCl 133，KCl 5.4，Hepes 5，Glucose 5，CaCl21.3，MgSO40.9，配制時準(zhǔn)確稱量后采用三蒸水配制，用1N 的NaOH 調(diào)節(jié)pH 至7.4，4mol／L NaCl將其滲透壓調(diào)節(jié)為300mmol／L。

1.4.2 IV 膠原酶液的配制 采用美國Sigma公司生產(chǎn)的IV 膠原酶，用Hepes液配制成濃度為0.5 mg／ml備用。

1.4.3 多聚賴氨酸粘附劑的配制 采用美國Sigma公司生產(chǎn)的多聚賴氨酸（poly－1－lysine），用三蒸水配制成0.25mg／ml溶液，取50μl加入ACAS 570專用培養(yǎng)皿中，無菌條件下風(fēng)干備用。

1.4.4 DIBAC4（3）熒光探針的配制 取DIBAC4（3）25μl（1mg／ml）加入Hepes液至10ml即成5 μM 液，避光冷藏備用。

1.5 OHC的分離及染色 在5個不同的時間點分別隨機(jī)活殺兩組中的2只豚鼠，于2分鐘內(nèi)取出聽泡，浸于Hepes液中，在解剖顯微鏡下分離出第2～4回基底膜，用微量加樣器吸取分離出的基底膜于玻璃試管中，加入等量的0.5 mg／ml IV 膠原酶（Sigma，用Hepes液配制，終濃度為0.25mg／ml），輕輕吹打5次，靜置10分鐘后用Hepes液洗滌3次；微量加樣器加入5μM 的DIBAC4（3）避光染色20分鐘；離心去除上清液。吸取50μl細(xì)胞懸液加入含有薄層多聚賴氨酸的特制培養(yǎng)皿中（Sigma，用三蒸水配成0.25mg／μl，50μl加入培養(yǎng)皿中，無菌風(fēng)干備用），靜置5分鐘。將培養(yǎng)皿置于ACAS 570載物臺上，顯微鏡下選取活性良好的OHC［2］進(jìn)行檢測。

1.6 OHC膜電位的檢測 選取活性良好的OHC，在靜息狀態(tài)下先掃描40秒后，將純音測聽儀輸出耳機(jī)距培養(yǎng)皿約10cm 高，由上而下對準(zhǔn)培養(yǎng)皿底部，采用2 000Hz純音，分別于掃描第40、70、100、140、170、200、225、240 及275s時予10、20、30、40、50、60、70、80及100dB HL純音刺激，每次持續(xù)3s，于100dB HL 時持續(xù)刺激60s，觀察OHC 內(nèi)熒光值的改變。上述實驗于室溫下（20～25 ℃）1小時內(nèi)完成，以確保OHC的良好活性。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析。豚鼠的離體單個OHC 首次聲刺激的去極化時間、首次去極化膜電位水平（熒光值）采用±s表示；對照組和輻射組之間的比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 靜息狀態(tài)下離體OHC熒光值特征 DIBAC4（3）為一種親陽離子的陰離子染料探針，其跨膜分布依賴于膜電位。在靜息狀態(tài)下OHC 呈現(xiàn)試管狀，DIBAC4（3）均勻、無規(guī)則分布于整個細(xì)胞質(zhì)中，胞漿的兩極相對集中，周邊較弱（圖1、2）。

2.2 對照組OHC膜電位變化規(guī)律 對照組豚鼠的離體單個OHC 在2 000 Hz不同強(qiáng)度純音刺激下，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度呈不同程度的增高（曲線上升），而刺激間歇時，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度亦開始回落（曲線下降），伴隨聲刺激的持續(xù)和間斷，曲線亦呈現(xiàn)上升、下降、再上升和再下降之變化規(guī)律，即OHC 產(chǎn)生去極化、復(fù)極化、再去極化和再復(fù)極化改變。圖3提示：予2 000Hz、10dB HL 純音聲刺激OHC 時，第40 s細(xì)胞內(nèi)熒光值開始升高，并于第50s達(dá)到峰值（1.112u），隨后細(xì)胞內(nèi)熒光值開始回落，于第60s至最低值（1.000u）。表明對照組OHC 首次去極化時間為10s，并于10s內(nèi)完成復(fù)極化。

2.3 輻射組OHC 膜電位變化規(guī)律 輻射組手機(jī)微波輻射后1 小時檢測結(jié)果表明，予2 000 Hz、10 dB HL純音刺激OHC時，第40s細(xì)胞內(nèi)熒光值亦開始升高，第65s達(dá)到峰值（1.100u），隨后細(xì)胞內(nèi)熒光值開始回落，至第二次聲刺激（第70s、20dB HL）開始時回落至1.045u。以后連續(xù)3次聲刺激時曲線有微上升，但都未能達(dá)到峰值和完全回落，提示手機(jī)微波輻射1小時后，OHC細(xì)胞膜的去極化和復(fù)極化時間明顯延長且不能完全去極化和復(fù)極化（圖4）。輻射6小時和12小時后，隨著間斷的聲刺激可見OHC內(nèi)熒光值緩慢上升，輻射6 小時組之毛細(xì)胞于第70s熒光值達(dá)峰值（1.100u），而輻射12小時組之毛細(xì)胞于第90s熒光值達(dá)峰值（1.050 u），隨后整條曲線呈微上升趨勢（圖5、6）。輻射24和48小時后，經(jīng)過聲刺激，曲線呈微上升、微下降波動，無明顯峰值及回落（圖7）。提示經(jīng)手機(jī)微波連續(xù)輻射24小時后，OHC無明顯去極化和復(fù)極化過程。

2.4 首次聲刺激OHC 膜電位熒光峰值變化規(guī)律 手機(jī)微波輻射1、6、12、24和48小時后，離體豚鼠OHC首次聲刺激后膜電位熒光峰值較對照組顯著降低（P＝0.000，P＜0.01）。輻射后1小時和6小時兩組相比較，OHC首次聲刺激后的膜電位熒光峰值水平差異無顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.129，P＞0.05），且OHC膜電位熒光值水平均為1.00u（圖4，5）。隨輻射時間的延長，首次聲刺激后OHC 膜電位熒光峰值水平逐漸下降，輻射時間越長，下降越明顯。

2.5 首次聲刺激OHC 去極化時間變化規(guī)律 手機(jī)微波輻射1、6、12小時后，OHC 首次去極化時間較對照組顯著延長（P＝0.000，P＜0.01）；隨著輻射時間的延長，OHC去極化時間明顯延長，輻射12小時后，去極化時間最長；輻射后各組與對照組比較差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.000，P＜0.01）；輻射24和48小時后，膜電位僅呈輕微、不規(guī)律的波動，沒有明顯的去極化過程（表1）。

表1 首次聲刺激后各組OHC膜電位熒光峰值和去極化時間（膜電位水平）（±s）

表1 首次聲刺激后各組OHC膜電位熒光峰值和去極化時間（膜電位水平）（±s）

組別膜電位的熒光值（u）去極化時間（s）1.112±0.002 9.92±0.16輻射組 輻射1小時1.087±0.116 24.97±0.18 輻射6小時1.081±0.014 30.49±0.98 輻射12小時1.046±0.003 50.00±1.27 輻射24小時1.021±0.007— 輻射48小時1.021±0.007對照組—

圖1 靜息狀態(tài)下對照組離體OHC形態(tài)及DIBAC4（3）熒光分布圖2 靜息狀態(tài)下輻射組輻射1h離體OHC形態(tài)及DIBAC4（3）熒光分布圖3 2 000Hz聲刺激后對照組OHC熒光值變化曲線

圖4 2 000Hz聲刺激后輻射1h組OHC熒光值變化曲線圖5 2 000Hz聲刺激后輻射6h組OHC熒光值變化曲線圖6 2 000Hz聲刺激后輻射12h組OHC熒光值變化曲線圖7 2 000Hz聲刺激后輻射24、48h組OHC熒光值變化曲線

3 討論

手機(jī)電磁輻射屬于微波波段，頻率為800～2 000 MHz。手機(jī)微波輻射能量以脈沖式重復(fù)遞增，其頻率高、波長短，對生物體的影響較大。目前使用最為普遍的手機(jī)是采用全球定位系統(tǒng)的數(shù)字手機(jī)，中心頻率為900 MHz，通過微波的微小調(diào)制來傳輸語音信息。有研究者［2］發(fā)現(xiàn)，電磁輻射對人體的作用主要是非熱效應(yīng)，并指出這與神經(jīng)系統(tǒng)方面的異常表現(xiàn)有關(guān)，電磁輻射對兒童的免疫功能和神經(jīng)系統(tǒng)影響更為突出。Monfrecola等［3］用手機(jī)輻射志愿者的耳部，然后測定皮膚的血流量，發(fā)現(xiàn)手機(jī)輻射組的血流量較對照組顯著升高。Moustafa等［4］試驗表明暴露于手機(jī)輻射場中1、2、4小時后，血漿中油脂過氧化物水平顯著增高，自由基清除劑超氧化物歧化酶活性顯著降低。有實驗室采用大白鼠模型來研究手機(jī)輻射的促癌作用，結(jié)論認(rèn)為長時間、高頻率使用移動電話能提高誘發(fā)腦部惡性腫瘤的風(fēng)險，并且顳葉的腫瘤尤為明顯，其中又以聽神經(jīng)瘤的患病風(fēng)險最高［5］。使用手機(jī)時通常是靠近或緊貼耳部，因此聽覺系統(tǒng)被認(rèn)為是最有可能受到影響的器官之一［6］。

耳蝸OHC的運動可增強(qiáng)基底膜振諧曲線對特征頻率的敏銳度，對內(nèi)毛細(xì)胞有驅(qū)動效應(yīng)作用，并間接影響內(nèi)毛細(xì)胞對振動刺激信號的敏感性。這表明OHC及其膜電位在人類聽覺生理中具有重要作用，其生理功能狀態(tài)對聽覺功能有直接的影響。當(dāng)耳蝸受到聲刺激時，在耳蝸及其附近結(jié)構(gòu)可記錄到一種特殊的電波動，通常稱之為微音電位［7］，這是一種由聲刺激誘發(fā)的、起源于許多OHC 且存在于細(xì)胞外的感受器交流總和電位，耳蝸微音電位主要來源是OHC（占80%～85%），而小部分來源于IHC（15%～20%）［8］。電阻調(diào)制學(xué)說認(rèn)為毛細(xì)胞頂部的膜內(nèi)、外存在著約140mV 的巨大電位差，OHC 膜可能起著一個可變電阻器的作用，其阻值隨著聽纖毛向不同方向的彎曲和復(fù)位而增大或減少，造成膜電阻的相應(yīng)波動，在膜兩側(cè)形成一個波動式的電壓變化，對原有的毛細(xì)胞靜息電位（－60 mV）和內(nèi)淋巴電位（＋80mV）進(jìn)行調(diào)制。當(dāng)耳蝸毛細(xì)胞受到機(jī)械刺激興奮后，產(chǎn)生耳蝸微音電位，傳入神經(jīng)的谷氨酸遞質(zhì)釋放激活鈣離子通道，引起蝸神經(jīng)末梢興奮產(chǎn)生動作電位，上傳至大腦皮層產(chǎn)生聽覺［8］。OHC膜電位的大小及變化決定了微音電位的大小及變化規(guī)律［9］。本研究中OHC膜電位改變的機(jī)理可能是微波輻射引起OHC 的鈣通道激活，使得鈣離子通透性增加并通過OHC 的胞膜內(nèi)流，使鈉－鈣交換受到抑制，胞內(nèi)鈣離子的增加改變了OHC 的膜電位和能動性。

耳蝸的聽覺過程是一個從機(jī)械刺激到發(fā)放神經(jīng)沖動的環(huán)節(jié)，耳蝸向聽覺中樞提供精確的聽覺信息，使中樞對聽覺信息進(jìn)行精細(xì)處理并對聽敏度起著關(guān)鍵的作用。本實驗采用ACAS 570粘附細(xì)胞儀、DIBAC4（3）熒光探針為檢測手段，以2 000Hz不同強(qiáng)度純音刺激作用于離體狀態(tài)下活OHC，動態(tài)觀察OHC膜電位的變化規(guī)律。ACAS 570 為粘附式細(xì)胞分析及篩選激光顯微鏡，具有高分辨率，可用于活細(xì)胞的功能研究，如細(xì)胞內(nèi)染色體、pH 值、離子濃度和膜電位測定等。DiBAC4（3）是一種膜電位敏感的親脂性陰離子熒光染料，該染料于去極化時進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度增加；復(fù)極化時從細(xì)胞內(nèi)移出，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度降低。根據(jù)其在細(xì)胞內(nèi)、外的重新分布，可判斷出細(xì)胞膜電位的變化［10］。本實驗中DiBAC4（3）熒光值與膜電位的對應(yīng)關(guān)系為：第40s予2 000Hz、10dB HL 純音刺激OHC 時，細(xì)胞內(nèi)熒光值開始升高，第50s達(dá)到峰值（1.112u），刺激間歇期細(xì)胞內(nèi)熒光值開始回落，第60s至最低值（1.000u），即OHC完全去極化時之膜電位所對應(yīng)的熒光值為1.112u，而完全復(fù)極化時膜電位所對應(yīng)的熒光值為1.000u。本實驗結(jié)果提示：當(dāng)予2 000Hz不同強(qiáng)度純音聲刺激對照組OHC 時，OHC產(chǎn)生規(guī)律性的去極化、復(fù)極化、再去極化和再復(fù)極化改變；手機(jī)微波輻射1小時后，OHC 細(xì)胞膜的去極化和復(fù)極化時間明顯增加，并且不能完全去極化和復(fù)極化；輻射時間超過6小時后，伴隨聲刺激曲線呈微上升、微下降波動，無明顯峰值及回落。提示手機(jī)微波連續(xù)輻射6小時后，OHC無明顯去極化和復(fù)極化過程，去極化的峰值明顯降低，動作電位產(chǎn)生的峰值也降低；當(dāng)輻射時間大于24h時，聲刺激后OHC基本不能出現(xiàn)膜電位變化。產(chǎn)生此結(jié)果的原因可能是由于手機(jī)微波輻射改變了OHC 膜表面的跨膜蛋白結(jié)構(gòu)，并進(jìn)而影響OHC 膜離子通透性及跨膜電位的形成［11］。

綜上所述：長時間的手機(jī)微波輻射能引起離體豚鼠耳蝸OHC膜離子通透性的改變，影響OHC膜電位的形成及細(xì)胞去極化、復(fù)極化，從而導(dǎo)致離體OHC膜電位對不同強(qiáng)度純音刺激的敏感性逐漸降低。至于手機(jī)微波輻射如何改變以及改變何種離子通透性，則有待進(jìn)一步實驗研究。本實驗不足之處是，2 000Hz不同強(qiáng)度純音刺激由空氣介質(zhì)進(jìn)入水溶液介質(zhì)時，將產(chǎn)生一定的折射損耗，作用于OHC的刺激強(qiáng)度有所減弱。因此，應(yīng)進(jìn)一步改進(jìn)實驗方法和手段，以獲得更加接近于生理狀態(tài)下的實驗結(jié)果。

1 Galloni P，Lovisolo GA，Mancini S，et al.Effects of 900 MHz electromagnetic fields exposure on cochlear cells＇functionality in rats：evaluation of distortion product otoacoustic emissions［J］.Bioelectromagnetics，2005，26：536.

2 Hyland GJ.Physics and biology of mobile elephony［J］.Lancet，2000，356：1833.

3 Monfrecola G，Moffa G，Procaccini EM.Non－ionizing electromagnetic radiations，emitted by a cellular phone，modify cutaneous blood flow［J］.Dermatology，2003，207：10.

4 Moustafa YM，Moustafa RM，Belacy A.Effects of acute exposure to the radiofrequency fields of cellular phones on plasma lipid peroxide and antioxidase activities in human erythrocytes［J］.J Pharm Biomed Anal，2001，26：605.

5 Lonn S，Ahlbom A，Hall P，et al.Mobile phone use and the risk of acoustic neuroma［J］.Epidemiology，2004，15：653.

6 Parazzini M，Tognola G，F(xiàn)ranzoni C.Modeling of the internal fields distribution in human inner hearing system exposed to 900and 1 800MHz［J］.IEEE Trans Biomed Eng，2007，54：39.

7 Maguin K，Campo P，Parietti Winkler C.Toluene can perturb the neuronal voltage－dependent Ca2＋channels involved in the middle－ear reflex［J］.Toxicol Sci，2009，107：473.

8 李興啟，孫建和，楊仕明，等.耳蝸病理生理學(xué)［M］.北京：人民軍醫(yī)出版社，2011.79～153.

9 Peleg U，Perez R，F(xiàn)reeman S.Salicylate ototoxicity and its implications for cochlear microphonic potential generation［J］.J Basic Clin Physiol Pharmacol，2007，18：173.

10 Yamda A，Gaja N，Ohya S，et al.Usefulness and limitation of DiBAC4（3），a voltage sensitive fluoresent dye for t he measurement of membrane potentials regulated by recombinant large conductance Ca2＋actived K＋channel in HEK293cells［J］.J Pharmacol，2001，86：342.

11 Zheng J，Shen W，He DZ.Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells［J］.Nature，2000，405：149.