TCAB1慢病毒表達載體的構(gòu)建及其在人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞中的表達

顧 林 史穎莉? 倪 婕 陳 捷 李 瑛

1.南京醫(yī)科大學附屬南京婦幼保健院，江蘇南京 210004；2.江蘇省計劃生育研究所，江蘇南京 210029

TCAB1是人腫瘤細胞中近期發(fā)現(xiàn)的端粒酶蛋白組分，其表達缺失可使端粒酶復(fù)合物無法運送至染色體末端的端粒合成目的地，雖不影響端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）對自身攜帶RNA組分（hTR）的催化，但最終仍導(dǎo)致端粒形成受限。由于：①端粒機制與惡性腫瘤等細胞的增殖、遷移、侵襲屬性密切相關(guān)[1-2]；②內(nèi)異癥雖為良性疾病，其遠處種植和生長特性卻與惡性腫瘤類似[3]。筆者前期研究中通過基因芯片實驗發(fā)現(xiàn)，TCAB1異常表達于內(nèi)異癥異位內(nèi)膜組織，提示TCAB1可能通過端粒機制參與了內(nèi)異癥異位內(nèi)膜的生長、侵襲等病理機制，并介導(dǎo)了在內(nèi)異癥形成中的作用。為進一步研究TCAB1功能及作用機制，筆者擬構(gòu)建TCAB1的慢病毒表達載體。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

總RNA抽提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；PCR Taq酶購自TaKaRa公司；限制 性內(nèi)切酶（EcoRI和NotI）購自NEB公司；感受態(tài)細胞TOP10實驗室自備；Agarose Gel DNA Purification Kit Ver2.0、TA克隆試劑盒購自TaKaRa；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（SuperScriptRⅢFirst-Strand Synthesis System）購自invitrogen公司；測序委托上海英俊生物公司進行；慢病毒過表達載體（pLVX-IRES-ZsGreen）購自Clonetech公司；子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞株（St-T1b）購自ATCC。

1.2 TCAB1（WRAP53）全長基因TA克隆

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)Genebank中報道的基因序列，應(yīng)用軟件設(shè)計TCAB1全長基因擴增引物（Invitrogen公司）：primer-F：CGGAATTCCGGCCATGAAGA CTTTGGAGACTCAAC；primer-R：ATTTGCGGCCGCACC TTATATCAGCTCA CC ACACCT；上下游引物分別含有EcoRI和NotI酶切位點；PCR終產(chǎn)物大小為1 675 bp。

1.2.2 RT-PCR TRIzol法抽提人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞總RNA，Nanodrop檢測RNA濃度，1%變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，如見清晰的18 S和28 S兩條帶，說明總RNA完整性較好。取1μg總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，PCR循環(huán)參數(shù)為：5℃冷卻10 mim、50℃孵育50 min、85℃5 min終止反應(yīng)。

1.2.3 目的基因片段擴增PCR 以巢式PCR技術(shù)將目的基因片段擴增，第一次PCR循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性5 min、94℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸90 s、72℃延伸10 min，共25個循環(huán)；第二次PCR循環(huán)參數(shù)同第一次PCR，共30個循環(huán)。凝膠掃描成像系統(tǒng)記錄電泳結(jié)果。

1.2.4 PCR產(chǎn)物TA克隆 將PCR產(chǎn)物使用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver 2.0回收，進行TA克隆，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞TOP10,使用含100 mg/mL氨芐抗生素的LB瓊脂平板篩選轉(zhuǎn)化子。挑取單個菌落，在含100 mg/mL氨芐抗生素的LB培養(yǎng)液中擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并分別用EcoRI-HF和NotI-HF進行酶切鑒定，酶切成功送英俊公司測序。

1.3 TCAB1（WRAP53）慢病毒表達載體構(gòu)建

將真核表達載體pLVX-IRES-ZsGreen1與測序成功的TCAB1-TA克隆用EcoRI和NotI雙酶切，膠回收線性化載體和PCR目的產(chǎn)物，用T4DNA連接酶連接線性化載體和PCR純化產(chǎn)物16°C過夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞top10，含100 mg/mL氨芐抗生素的LB瓊脂平板篩選轉(zhuǎn)化子。挑取單個菌落，在含100 mg/mL氨芐抗生素的LB培養(yǎng)液中擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并分別用EcoRI和NotI進行酶切鑒定。

1.4 慢病毒包被

將HEK293T細胞（病毒包被細胞）均勻接種于培養(yǎng)皿中，待細胞融合度至70%左右時，轉(zhuǎn)染慢病毒表達質(zhì)粒與包被質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒比例（μg）為2.5∶1.0，慢病毒表達質(zhì)粒與Pcgvp、Rev、Vsvg比例為1.5∶1.5∶1.0∶0.5，轉(zhuǎn)染48、72 h后收取病毒上清，2 000 g離心10 min棄細胞碎片，上清經(jīng)0.45μm濾器過濾后分裝，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 慢病毒感染子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞

傳代培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞株（St-T1b），將其接種于6孔板中（105/mL），待細胞融合度達60%左右時，加入病毒上清，同時加入終濃度5μg/mL的poly brene，培養(yǎng)72 h在熒光顯微鏡觀察熒光表達情況以判斷感染效率。

1.6 實時定量PCR檢測過表達效果

收集感染過表達慢病毒的人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞株，以空載慢病毒做對照。按照TRIzol試劑說明書提取細胞中總RNA，并進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA產(chǎn)物。以此cDNA為模板，在ABI 7500型實時定量PCR儀上進行實時定量PCR反應(yīng)。引物序列為Sense:5′-cagccagacacctcctacg-3′，Anti-sense:5′-tgaatgcgtcccagatat-3′，Roche LNA probe:#66（CAGCAGCC）；18s sense:5′-gcaattattccccatgaacg-3′，Anti-sense:5′-gggacttaatcaacgcaagc-3′，Roche LNA probe:#48（TTCCCAGT）。實時定量PCR反應(yīng)體系為：Master Mix 10μL，cDNA 1μL，引物探針共1μL，雙蒸水8μL，共20μL。擴增條件：預(yù)變性95℃2min后，95℃10s，60℃30s，70℃45s，重復(fù)40個循環(huán)。用△△CT法計算TCAB1的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 基因擴增結(jié)果

以基因組為模板進行PCR擴增，得到大小為1 675 bp的片段（圖1），DNA測序證明擴增片段的核苷酸序列與Genbank中的TCAB1序列完全一致。

圖1 目的基因TCAB1的PCR產(chǎn)物凝膠電泳分析

2.2 TA克隆鑒定

結(jié)果顯示提取的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶酶切后得到了與設(shè)定長度一致的TCAB1 cDNA片段，酶切成功送英俊公司測序，雙向測通，經(jīng)比對后，與Genbank比對后，無堿基突變。

2.3 TCAB1（WRAP53）慢病毒表達載體鑒定

構(gòu)建慢病毒表達質(zhì)粒，提取質(zhì)粒并分別用EcoRI和NotI進行酶切鑒定，結(jié)果顯示構(gòu)建成功（圖2）。

圖2 慢病毒載體構(gòu)建與酶切鑒定

2.4 檢測TCAB1基因在St-T1b細胞中的過表達效果

熒光顯微鏡下觀察：TCAB1基因重組慢病毒感染靶細胞后，可見較大比例的St-T1b表達綠色熒光（圖3A），提示TCAB1慢病毒感染成功；實時定量PCR法檢測結(jié)果提示：TCAB1基因重組慢病毒感染的細胞中TCAB1顯著過表達（圖3B）。證明TCAB1基因經(jīng)重組慢病毒載體感染至St-T1b細胞后，能夠在靶細胞中穩(wěn)定持續(xù)表達。

3 討論

TCAB1是端粒酶的新蛋白組分，它主要位于細胞核卡哈爾體內(nèi)，控制端粒酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。進行生物信息學分析后發(fā)現(xiàn)，該基因（NM_001143990.1）mRNA全長1 837 bp，開放閱讀框1 647 bp，編碼548個氨基酸，預(yù)測分子量59.3 kDa；NCBI在線Blast Genome分析提示，TCAB1基因定位于染色體17p13.1；運用TMHMM2.0、SignaliP和WoLF PSORT等生物信息學工具分析其蛋白屬性發(fā)現(xiàn)，其編碼蛋白無跨膜區(qū)，可能位于胞漿內(nèi)。TCAB1位于細胞核卡哈爾體內(nèi)，控制端粒酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，與端粒形成密切相關(guān)[4]。已知TCAB1在多種腫瘤細胞中異常表達，能夠促進細胞轉(zhuǎn)移[5]。內(nèi)異癥具有類似惡性腫瘤的遠處種植和生長特性，文獻已證實內(nèi)異癥在位內(nèi)膜組織中端粒酶活性與端粒長度高于正常內(nèi)膜[6]，但未見涉及TCAB1、端粒酶、端粒在內(nèi)異癥形成中功能研究的相關(guān)報道。由于TCAB1功能尚不是很清楚，因此構(gòu)建該基因的過表達載體十分必要。

實現(xiàn)基因的過表達（gain of function）是基因功能研究的重要策略，其中慢病毒載體是基因表達的重要工具。慢病毒載體是以人類免疫缺陷Ⅰ型病毒為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體，該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久表達。同時由于對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力，對于干細胞和原代細胞研究具有重要意義。慢病毒的感染效率高、激發(fā)免疫反應(yīng)的作用弱，而且目前沒有證據(jù)表明其對宿主細胞有毒性作用或影響宿主細胞的活力。慢病毒表達載體感染后所獲得的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞基因表達穩(wěn)定、持續(xù)時間長，避免了瞬時轉(zhuǎn)染每次試驗均需重復(fù)操作的試驗過程，而且也避免了瞬時轉(zhuǎn)染時所需轉(zhuǎn)染試劑對實驗的影響。因此本實驗選擇慢病毒載體研究基因的工具。本實驗選擇的慢病毒表達載體是pLVX-IRES-ZsGreen1，ZsGreen1熒光蛋白可以作為包被及病毒感染時候的marker，可以方便的觀察轉(zhuǎn)染和病毒感染效率，也可以在后續(xù)研究中通過熒光篩選穩(wěn)定表達株。本實驗成功構(gòu)建人TCAB1基因特異性的重組慢病毒過表達載體,且證實包被的慢病毒可實現(xiàn)TCAB1基因在人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞株的過表達，為后續(xù)人TCAB1在人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞的功能研究奠定了良好的實驗基礎(chǔ)。

[1]Goldblatt EM，Gentry ER，F(xiàn)ox MJ，et al.The telomerase template antagonist GRN163L alters MDA-MB-231 breast cancer cell morphology，inhibits growth，and augments the effects of paclitaxel[J].Mol Cancer Ther，2009，8（7）：2027-2035.

[2]Huang W，Rha GB，Chen L，et al.Inhibition of telomerase activity alters tight junction protein expression and induces transtendo helial migration of HIV-1 infected cells[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2010，298（4）：1136-1145.

[3]Taylor RN，Yu J，Torres PB，et al.Mechanistic and therapeutic implications of angiogenesis in endometriosis[J].Reprod Sci，2009，16（2）：140-146.

[4]Mahmoudi S，Henriksson S，WeibrechtⅠ，et al.WRAP53 is essential for Cajal body formation and for targeting the survival of motor neuron complex to Cajal bodies[J].PLoS Biol，2010，8（11）：e1000521.

[5]Mahmoudi S，Henriksson S，F(xiàn)arnebo L，et al.WRAP53 promotes cancer cell survival and is a potential target for cancer therapy[J].Cell Death Dis，2011，2：114.

[6]Hapangama DK，Turner MA，Drury JA，et al.Endometriosis is associated with aberrant endometrial expression of telomerase and increased telomere length[J].Hum Reprod，2008，23（7）：1511-1519.