電針對先天性腦損傷仔鼠腦白質神經髓鞘修復的影響

翟洪建 王風波 虞樂華

1.成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院康復醫(yī)學科，四川成都 610500；2.重慶醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院康復醫(yī)學科，重慶 400010

宮內感染（intrauterine infection）作為新生兒腦白質損傷（NWMD）的重要致病因素，已得到廣泛證實。少突膠質細胞（OL）及腦白質神經髓鞘的損傷均是NWMD的主要病理特點，OL的成熟前體是少突膠質前體細胞（OPCs），對感染和缺血極為敏感。本研究建立先天性腦損傷仔鼠模型，經電針干預治療，電子顯微鏡下觀察腦白質神經髓鞘的超微結構，測量并計算出髓鞘厚度平均值，進而從髓鞘厚度的角度探討電針治療對先天性腦損傷及腦白質神經髓鞘修復的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級成熟Wistar雌性大鼠38只，雄性大鼠19只，體重≥210 g，全部由四川動物實驗中心提供；脂多糖（LPS血清型055：B5，美 國SIGMA公 司）；120KV透 射 電 子 顯 微 鏡（JEM-1200EX)（日本電子株式會社）。

1.2 方法

參照王風波等[1]方法使用的制備宮內感染致先天性腦損傷仔鼠模型。孕鼠隨機分為生理鹽水對照組（n=4）和LPS組（n=29），兩組均去除孕22 d前分娩的早產鼠。仔鼠出生后，對胎盤做HE染色病理學檢測，大量的中性粒細胞浸潤為宮內感染的判斷標準。隨機選取生理鹽水對照組仔鼠22只（n=22），LPS組仔鼠40只（n=40）；LPS組仔鼠隨機分為非干預組22只（n=22）、電針組18只（n=18）；于24 h隨機處死對照組和非干預組仔鼠各4只，行腦組織病理學檢測。電針組仔鼠于第7天開始進行電針干預，對照組、非干預組仔鼠均常規(guī)飼養(yǎng)。分別于第14天、第28天取各組仔鼠腦白質測量神經髓鞘厚度。

1.3 電針干預

選取仔鼠百會、曲池及足三里諸穴，具體操作參照《實驗針灸學》[2]及王風波等[1]方法：仔鼠頂骨正中定百會，橈骨近端的關節(jié)外側凹陷處取曲池，膝關節(jié)后外側腓骨小頭下約5 mm處定足三里，采用直徑0.2 mm、長20 mm的華佗牌針灸針，各穴均連接電針儀，調設連續(xù)波，5～10 Hz頻率，3～5 V強度，以頭部輕微抖動為宜，持續(xù)刺激10 min。每日1次，干預至第28天。

1.4 電鏡標本及圖片制作

參照王風波等[3]方法制備常規(guī)腦白質電鏡標本，用球切法（isector）包埋抽取出的腦白質組織塊，確保各方向分布的神經纖維均有相同抽樣概率，再以常規(guī)電鏡包埋法包埋組織塊，每個包埋好的腦白質組織塊隨機切取一張60 nm的超薄切片，透射電子顯微鏡下觀察髓鞘情況，每張切片隨機選取5個視野，放大20 000倍拍照。

1.5 腦神經髓鞘厚度測量方法

參照Larsen[4]方法，在放大20 000倍的照片上隨機疊加等距測試線，計數(shù)每個待測髓鞘斷面的內外邊界與測試線的交叉點數(shù)，將髓鞘內邊界與測試線的交點按順序編號，總數(shù)為I，隨機選取前I/4中的一個編號作為首個髓鞘厚度的測試點，其所在位置+I/4為第二個測試點，第三個測試點為第二點位置+I/4，第四個測試點為第三點位置+I/4，于這4個測試點處分別測量髓鞘內外邊界的最短距離，取其平均值為髓鞘厚度。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗,多組間均數(shù)比較采用q檢驗，非正態(tài)分布和方差不齊時，用秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 胎盤病理檢查結果及新生仔鼠腦組織病理改變

LPS組孕鼠胎盤內見大量中性粒細胞浸潤，對照組母鼠胎盤無炎癥反應。LPS組仔鼠腦白質結構疏松，其內大量膠質細胞聚集，并有血管擴張，腦室內出血等病理改變；對照組仔鼠腦白質結構完整，無明顯膠質細胞聚集、血管擴張及出血等，且核仁清楚，布局有序。

2.2三組仔鼠腦白質神經髓鞘厚度測量結果

非干預組、電針組仔鼠腦白質神經髓鞘厚度平均值均明顯低于對照組，組間差異有高度統(tǒng)計學意義（P﹤0.01）；電針組仔鼠髓鞘厚度平均值高于非干預組（P﹤0.01）；各組第14天與第28天組內比較，差異均有高度統(tǒng)計學意義（P﹤0.01）。見表1、圖1～3。

表1 三組仔鼠腦神經髓鞘平均厚度檢測情況比較(±s)

表1 三組仔鼠腦神經髓鞘平均厚度檢測情況比較(±s)

注：與對照組比較，*P﹤0.01；與非干預組比較，△P﹤0.01；與同組14 d比較，▲P﹤0.01

組別14 d只數(shù) 髓鞘平均厚度（nm）28 d只數(shù) 髓鞘平均厚度（nm）對照組非干預組電針組999 109.7667±9.7985 65.4457±6.9376*88.5768±2.6786*△999 126.5667±4.5768▲88.4465±5.3365*▲110.5546±4.6673*△▲

圖1 對照組14日齡仔鼠腦白質神經髓鞘（電鏡×20 000）

圖2 非干預組14日齡仔鼠腦白質神經髓鞘（電鏡×20 000）

圖3 電針組14日齡仔鼠腦白質神經髓鞘（電鏡×20 000）

3 討論

神經髓鞘由OL突起的胞膜包卷軸突而成，脫髓鞘損害與OL受損息息相關。中樞神經系統(tǒng)（CNS）髓鞘缺失的主要因素包括髓鞘合成障礙及過多破壞兩方面，髓鞘合成障礙多見于先天性損傷，如腦室周圍白質軟化（PVL），髓鞘的過多破壞則見于繼發(fā)于全身性疾病和炎性脫髓鞘病(IIDDs)[5]。PVL通常出現(xiàn)于妊娠第28～34周，是NWMD的主要表現(xiàn)形式。宮內感染是WMD的重要病因之一，不但可以直接侵犯胎兒中樞神經系統(tǒng)，而且可以通過引起炎癥反應和干擾胎盤血流循環(huán)致胎兒腦的血供減少，引起胎兒中樞神經系統(tǒng)炎性和缺血性損傷[6]。王風波等[3]研究顯示，宮內感染可致腦損傷仔鼠腦白質神經脫髓鞘損害。OL是神經膠質細胞的主要類型之一，主要參與髓鞘的形成，其成熟前期的OPCs對感染和缺血極為敏感，NWMD的主要病理表現(xiàn)即包括髓鞘與軸突的損害。髓鞘的修復與再生是人體復雜的自我調節(jié)功能之一，神經元及神經膠質細胞均參與到其各個階段的精細調控，大腦白質內大量的并行的髓鞘化軸突毗鄰OL，接受OL提供的髓鞘形成所需的必要物質，若OL受到損傷，與其毗鄰的軸突便將面臨髓鞘缺損的狀況。OL還可合成新的髓鞘來包繞暴露的軸突，并且通過釋放各種神經營養(yǎng)因子促使受損軸突的修復[7]；同時，遭受失髓鞘的神經元自身的功能恢復，也對髓鞘的修復和再生有著重要的作用。另外，神經膠質細胞的另外兩種類型：小膠質細胞和星形膠質細胞，在WMD發(fā)生后很快反應，通過次級激活，產生數(shù)量龐大的細胞因子，進而激活前體細胞，對于髓鞘再生亦是不可或缺的因素[8]。而早期的積極干預對WMD的治療作用毋庸置疑，王風波等[3]發(fā)現(xiàn)，早期豐富康復訓練不但能在形態(tài)上改善腦損傷仔鼠腦白質神經髓鞘的狀況，并且能顯著地增強仔鼠腦組織腦源性神經營養(yǎng)因子（BDNF）的陽性表達，對受損神經髓鞘的修復和再生具有積極地促進作用。

針刺治療腦損傷歷史悠久，療效確切，對于穴位的解釋，傳統(tǒng)醫(yī)學認為，百會屬督脈穴，與腦密切相關，曲池、足三里屬陽明經合穴，功效醒腦開竅，針刺督脈百會穴及陽明經合穴治療腦損傷，可振奮周身之陽氣，疏經通絡，促進氣血運行，促進肢體功能康復。電針療效明顯優(yōu)于單純針刺或電刺激，已得到大量研究證實。王風波等[3]取“百會、足三里”諸穴，對先天性腦損傷仔鼠進行電針干預，發(fā)現(xiàn)腦損傷仔鼠腦組織BDNF陽性表達明顯增強，對于腦損傷的功能重塑及恢復具有積極意義；芮君等[9]電針刺激腦缺血大鼠“百會、風府”穴，腦組織BrdU／NSE和Brdu／GFAP陽性細胞的數(shù)量均明顯增多，進而促進中樞神經干細胞增殖分化。

基于以上理論及研究成果，本研究采用宮內感染致先天性腦損傷仔鼠模型，參考王風波等[3]采用的體視學技術，測量仔鼠腦白質神經髓鞘厚度并計算平均值，從腦白質神經髓鞘厚度的角度探討電針對先天性腦損傷的治療作用。通過實驗結果，本研究說明，積極而早期的電針干預可提高腦白質神經髓鞘厚度平均值，有利于腦白質神經髓鞘的修復與再生，為進一步研究電針在小兒腦損傷治療的臨床運用方面提供一定的客觀依據和積極的指導意義。

[1]王風波，李曉捷，唐明薇.電針對先天性腦損傷仔鼠腦組織腦源性神經生長因子表達的影響[J].中國中西醫(yī)結合兒科學雜志，2011，3（3）：213-216.

[2]李忠仁.實驗針灸學[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2003：22-27.

[3]王風波，李曉捷，唐明薇.豐富康復訓練對先天性腦損傷仔鼠腦神經髓鞘發(fā)育和修復的影響[J].中國傷殘醫(yī)學雜志，2011，19（9）：6-9.

[4]Larsen JO.Stereology of nerve cross sections[J].J Neurosci Methods，1998，85（1）：107-118.

[5]戚曉昆.中樞神經系統(tǒng)特發(fā)性炎性脫髓鞘病臨床進展[J].中國神經免疫學和神經病學雜志，2008，15（2）：77-79.

[6]程璐，陳曉光.TORCH病原及其檢測技術研究進展[J].中國病原生物學雜志，2008，3（3）：223-226.

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[8]方依卡.中樞神經系統(tǒng)髓鞘再生的生物學機制[J].臨床醫(yī)學工程，2010，17（3）：154-155.

[9]芮君，裴海濤.電針刺激對腦缺血大鼠神經干細胞分化的影響[J].上海針灸雜志，2011，47（4）：326-327.