光敏化促進姜黃素誘導人胃癌MGC－803 細胞凋亡*

曠焱平， 陳 墾△， 何博華， 王林靜， 祝愛珍， 劉成成， 劉革修

(廣東藥學院1護理學院，2臨床學院，3公共衛(wèi)生學院，廣東 廣州510006;4暨南大學醫(yī)學院血液學研究所，廣東 廣州510632)

姜黃素是活血藥中藥姜黃的主要成分，屬于天 然酚類抗氧化劑，其抗腫瘤作用日益引起人們的重視，已成為腫瘤預防和治療的一個研究熱點，美國國立腫瘤研究所已將其列為第3 代癌化學預防藥。姜黃素通過誘導細胞凋亡達到抗腫瘤作用已被不少文獻報道［1－2］。而且陳瑞川等［3］首次發(fā)現(xiàn)姜黃素在光照條件下可降低姜黃素誘導人胃腺癌MGC－803 細胞凋亡所需要的濃度，即15 W、光距20 cm 的日光燈照射下有促進姜黃素誘導細胞凋亡的效應，但是沒有研究其機制。本研究以人胃腺癌MGC－803 細胞為研究對象，探討了激光照射姜黃素(光敏化)誘導細胞凋亡及其機制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 材料 人胃腺癌MGC－803 細胞株(中山大學動物實驗中心提供)，姜黃素(Sigma)，小牛血清和RPMI－1640 培養(yǎng)液(華美公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)及藥物處理 人胃腺癌MGC－803細胞于含10%小牛血清、1 ×105U/L 青霉素及100 mg/L 鏈霉素的RPMI－1640 培養(yǎng)液、5%CO2、37 ℃培養(yǎng)傳代。細胞按(1 ～2)×108/L 接種，37 ℃培養(yǎng)24 h 后按實驗要求加入一定濃度的姜黃素，對照組加同量的溶劑，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后即收集細胞。姜黃素0.1842 g 先用100 μL 二甲基亞砜(DMSO)溶解后，用無水乙醇定容至50 mL，即為10 mmol/L 姜黃素母液，分裝0.5 mL/管，－20 ℃避光凍存。應用時以細胞培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。

2 方法

2.1 姜黃素吸收光譜測定 配成濃度為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 μmol/L 姜黃素溶液，用Lambda 35 紫外/可見分光光度計(Perkin－Elmer)測定姜黃素吸收光譜(波長范圍200 ～1 100 nm)，反復測定10 個樣本各10 次，統(tǒng)計、擬合光譜曲線，確定光譜峰值所在波長(即可活化姜黃素，發(fā)揮其光敏活性的最佳波長)為本實驗照射所用激光的波長。

2.2 MTT 法測定姜黃素對細胞生長的抑制作用

取對數(shù)生長期MGC－803 細胞，調(diào)整密度為2 ×108/L，每孔100 μL，姜黃素濃度為1、5、10、15、20 μmol/L，設3 個復孔，同時設DMSO 對照孔和不加細胞的調(diào)零孔，5% CO2、飽和濕度、37 ℃孵育72 h，加入MTT 試劑孵育3 h 后在全自動酶標儀上檢測各孔的吸光度值(測量波長490 nm)。癌細胞生長抑制率(%)= (1－實驗組平均吸光度值/空白組平均吸光度值)×100%。根據(jù)實驗結(jié)果數(shù)據(jù)計算得IC50=10.9 μmol/L，以此確定后續(xù)實驗姜黃素濃度為5 μmol/L。

2.3 光敏化促進姜黃素對癌細胞的作用觀察 實驗分組:空白組、單純姜黃素組、單純激光照射(pure light)組和姜黃素+激光照射(光動力學治療，photodynamic therapy，PDT)組。單純光照組和姜黃素+PDT 組都采用功率和波長都連續(xù)可調(diào)的全固態(tài)連續(xù)鈦寶石激光器(COHERENT，model:899－05)照射。單純姜黃素組為5 μmol/L 姜黃素。姜黃素+ PDT組為5 μmol/L 姜黃素和用可發(fā)揮姜黃素光敏活性的波長的激光照射(波長為405 nm 藍光，照射時間為15 min，照射劑量為40 J/cm2)。空白組和單純姜黃素組則不用上述波長的激光照射。

2.4 Annexin V－PI 雙染測定細胞凋亡 取對數(shù)生長的MGC－803 細胞，每孔2.5 ×105個細胞接種至6 孔板內(nèi)，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后分組并進行相關處理，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后用不含EDTA 的胰酶消化收集細胞，加入200 μL 試劑盒提供的結(jié)合緩沖液，重懸細胞后，加入5 μL Annexin－Ⅴ和10μL PI 染料后充分混勻，避光反應15 min 后進行流式細胞儀檢測。含有“亞二倍體”DNA 的細胞被認為是凋亡細胞，并測凋亡細胞比率。其結(jié)果用ModFitLT for Mac 3.0 軟件分析。

2.5 Hoechst 33258 熒光染色觀察細胞核形態(tài) 將MGC－803 細胞接種于含蓋玻片的培養(yǎng)板中進行細胞爬片，70%匯合時，分組進行藥物處理，48 h 后棄培養(yǎng)液，PBS 清洗2 遍，加入0.5 mL/well 4%多聚甲醛固定液固定20 min，PBS 清洗2 遍，加入Hoechst 33258 染色液染色20 min，PBS 洗2 遍，每次5 min，自然干燥后用中性甘油封片. 熒光顯微鏡下觀察細胞核形態(tài)并拍照。

2.6 流式細胞儀檢測線粒體膜電位、活性氧和細胞內(nèi)Ca2+取對數(shù)生長期細胞，以每孔5 ×104個細胞接種至12 孔板，貼壁培養(yǎng)12 h 后進行處理，之后6 h、12 h、24 h 時收集細胞，PBS 洗滌2 遍。500 μL JC－1(10 mg/L)重懸細胞檢測線粒體膜電位，500 μL DCFH－DA (5 μmol/L)重懸細胞檢測細胞產(chǎn)生的活性氧，10 μmol/L 熒光染料Fluo－3AM 檢測細胞內(nèi)Ca2+濃度，37 ℃避光孵育20 min，PBS 洗3 次，即刻用流式細胞儀檢測線粒體膜電位、活性氧和細胞內(nèi)Ca2+。

2.7 比色法檢測caspase－3、caspase－8 和caspase－9 酶活性 取對數(shù)生長期細胞，以每孔5 ×104個細胞的密度接種至12 孔板，貼壁培養(yǎng)12 h 后進行處理，之后6、12、24 h，按照試劑盒說明收集細胞，預冷PBS 洗滌后重懸于細胞裂解液中，冰上裂解30 min，4 ℃、10 000 × g 離心10min，取上清加入顯色底物(caspase－3 底物Ac－DEVD－pNA、caspase－8 底物Ac－IETD－pNA 和caspase－9 底物Ac－LEHD－pNA)，終濃度50 μL/L，均勻混合并加入到96 孔板中，每組5 個復孔，避光孵育4 h，酶標儀在波長405 nm 處檢測A 值。

2.8 Western blotting 檢測細胞色素C、Bcl－2、Bax和熱休克蛋白70(heat－shock protein 70，HSP70)表達水平 取對數(shù)生長期細胞，貼壁培養(yǎng)12 h 后進行處理，之后48 h 時收集細胞PBS 洗2 遍，加入蛋白抽提液抽提總蛋白;細胞色素C 測定是按試劑盒抽提胞漿及線粒體蛋白。取蛋白50 μg，經(jīng)10% SDS－PAGE 電泳分離，常規(guī)轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，Ⅰ抗4 ℃孵育過夜，以β－actin 作內(nèi)參照，1∶5 000 稀釋的HRP 標記的Ⅱ抗室溫孵育1 h，化學發(fā)光法分析蛋白表達。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 15.0 for Windows 統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計。率的比較采用χ2檢驗，計量資料采用t 檢驗或單因素方差分析，用LSD 法對需要比較的組間均值進行兩兩比較。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 姜黃素吸收光譜

姜黃素吸收波長在360 ～480 nm 范圍內(nèi)，提示姜黃素在此波長范圍中有明顯的PDT 作用。

2 光敏化姜黃素對人胃腺癌MGC－803 細胞增殖的影響

單純光照對MGC－803 細胞增殖沒有明顯抑制作用，單純5μmol/L 姜黃素對MGC－803 細胞增殖則顯示明顯抑制作用，細胞抑制率為(29.74 ±2.30)%;光敏化則可以進一步增強姜黃素對MGC－803 細胞增殖的抑制作用，細胞抑制率為(44.93 ±3.61)%。單純姜黃素組與空白組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01);姜黃素PDT 組與單純姜黃素組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01)，見表1。

3 光敏化促進姜黃素誘導人胃腺癌MGC－803 細胞凋亡

由圖1 和表2 可知，單純光照對MGC－803 細胞生長及其凋亡沒有明顯作用;單純5 μmol/L 姜黃素能夠影響MGC－803 細胞的周期分布，誘導MGC－803 細胞凋亡:G0/G1期細胞明顯增多，G2/M 期細胞下降，并且出現(xiàn)明顯亞G1二倍體峰，其細胞凋亡率為(12.54 ±1.75)%;光敏化則可以進一步增強姜黃素誘導MGC－803 細胞凋亡，其細胞凋亡率為(26.58 ±2.67)%。單純姜黃素組與空白組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01);姜黃素PDT 組與單純姜黃素組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01)。

表1 光敏化姜黃素對人胃腺癌MGC－803 細胞增殖的影響Table 1. Effects of photoactivated curcumin on proliferation of human gastric cancer MGC－803 cells (%. ±s.n =10)

表1 光敏化姜黃素對人胃腺癌MGC－803 細胞增殖的影響Table 1. Effects of photoactivated curcumin on proliferation of human gastric cancer MGC－803 cells (%. ±s.n =10)

＊＊P ＜0.01 vs control group;△△P ＜0.01 vs curcumin group.PDT:photodynamic therapy.

Croup Inhibitory rate Control 2.85 ±0.87 Pure light 3.38 ±0.94 Curcumin 29.74 ±2.30＊＊Curcumin+PDT 44.93 ±3.61△△

Figure 1. Photoactivation promoted curcumin to induce the apoptosis of human gastric cancer MGC－803 cells(flow cytometry).A:control group;B:pure light group;C:curcumin group;D:curcumin+PDT (photodynamic therapy)group.圖1 光敏化促進姜黃素誘導人胃癌MGC－803 細胞凋亡

表2 光敏化姜黃素對人胃腺癌MGC－803 細胞細胞周期和凋亡的影響Table 2. Effects of photoactivated curcumin on cell cycle and apoptosis of human gastric cancer MGC－803 cells(%. ±s.n=10)

表2 光敏化姜黃素對人胃腺癌MGC－803 細胞細胞周期和凋亡的影響Table 2. Effects of photoactivated curcumin on cell cycle and apoptosis of human gastric cancer MGC－803 cells(%. ±s.n=10)

＊＊P ＜0.01 vs control group;△△P ＜0.01 vs curcumin group.

Group G0/G1 S G2/M Apoptotic rate Control 39.65±4.97 26.92±3.74 33.43±3.95 3.34±0.55 Pure light 38.74±4.95 25.54±3.60 35.72±3.86 2.85±0.48 Curcumin 58.53±5.23 21.41±3.17 20.06±3.84 12.54±1.75＊＊Curcumin+PDT 64.70±5.67 19.71±3.20 15.59±3.02 26.58±2.67△△

Hoechst 33258 染色顯示，空白組、單純光照組基本沒有明顯的形態(tài)學變化，姜黃素作用48 h 后，在光學顯微鏡下可見部分人胃腺癌MGC－803 細胞胞體收縮、核濃縮，呈現(xiàn)特異性紫藍色，即判斷為凋亡細胞。姜黃素PDT 組可見明顯的細胞核形態(tài)改變，表現(xiàn)為染色質(zhì)凝集，并有染色質(zhì)的凋亡小體形成，此外也可見到核邊緣模糊，核區(qū)形態(tài)不規(guī)則，熒光微弱且不均勻的壞死細胞，見圖2。

4 姜黃素及其光敏化對MGC－803 細胞線粒體膜電位、活性氧和細胞內(nèi)Ca2+的影響

單純姜黃素作用于MGC－803 細胞，線粒體膜電位在6 h 時已顯著下降，24 h 時下降至最低;細胞內(nèi)活性氧在6 h 時也顯著升高，24 h 時仍然維持高水平;細胞內(nèi)Ca2+在6 h 時顯著升高，24 h 時下降至接近對照組水平。光敏化姜黃素作用MGC－803 細胞，則可進一步影響線粒體膜電位、活性氧和細胞內(nèi)Ca2+的變化，與單純姜黃素作用比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01)，見表3。

Figure 2. Effects of photoactivated curcumin on MGC－803 cell nuclear morphology (Hoechst 33258 staining， ×200).A :control group;B:pure light group;C:curcumin group;D:curcumin+PDT group.圖2 光敏化和姜黃素對MGC－803 細胞核形態(tài)的影響

表3 光敏化姜黃素與單純姜黃素對MGC－803 細胞線粒體膜電位、活性氧和細胞內(nèi)Ca2+的影響Table 3. Effects of photoactivated curcumin or curcumin on mitochondria membrane potential(MMP)，ROS and Ca2+ in MGC－803 cells (%. ±s.n=5)

表3 光敏化姜黃素與單純姜黃素對MGC－803 細胞線粒體膜電位、活性氧和細胞內(nèi)Ca2+的影響Table 3. Effects of photoactivated curcumin or curcumin on mitochondria membrane potential(MMP)，ROS and Ca2+ in MGC－803 cells (%. ±s.n=5)

＊＊P ＜0.01 vs curcumin group.

Group 2+MMP ROS Ca 6 h 12 h 24 h 6 h 12 h 24 h 6 h 12 h 24 h Photoactivated curcumin 79.5±5.5＊＊ 70.8±5.5＊＊ 66.2±5.5＊＊ 134.9±5.8＊＊ 120.4±5.8＊＊ 115.7±5.8＊＊ 127.6±5.6＊＊ 105.3±5.6＊＊ 104.6±5.6＊＊Curcumin 90.9±5.5 80.7±5.5 81.6±5.5 109.7±5.8 106.4±5.8 103.2±5.8 109.9±5.6 102.1±5.6 1 01.8±5.6

5 姜黃素及其光敏化對MGC－803 細胞caspase－3、caspase－8 和caspase－9 酶活性的影響

單純姜黃素作用于MGC－803 細胞，凋亡蛋白caspase－3、caspase－8 和caspase－9 酶活性增加;而光敏化姜黃素作用MGC－803 細胞，則可進一步增加caspase－3、caspase－8 和caspase－9 酶活性的變化，與單純姜黃素比較，差異顯著(P ＜0.01)，見表4。

表4 光敏化姜黃素與單純姜黃素對MGC－803 細胞caspase－3、caspase－8 和caspase－9 酶活性的影響Table 4. Effects of photoactivated curcumin or curcumin on the activity of caspase－3，caspase－8 and caspase－9 in MGC－803 cells(%. ±s.n=5)

表4 光敏化姜黃素與單純姜黃素對MGC－803 細胞caspase－3、caspase－8 和caspase－9 酶活性的影響Table 4. Effects of photoactivated curcumin or curcumin on the activity of caspase－3，caspase－8 and caspase－9 in MGC－803 cells(%. ±s.n=5)

＊＊P ＜0.01 vs curcumin group.

Caspase－3 Caspase－8 Caspase－9 6 h 12 h 24 h 6 h 12 h 24 h 6 h 12 h 24 h Curcumin 107.2±5.3 111.5±5.3 115.9±5.3 115.3±5.7 117.2±5.7 119.4±5.7 112.4±5.3 114.8±5 Group.3 118.7±5.3 Photoactivated curcumin 116.8±5.3＊＊ 126.7±5.3＊＊ 128.5±5.3＊＊ 127.4±5.7＊＊ 126.5±5.7＊＊ 125.4±5.7 ＊＊ 122.7±5.3＊＊ 126.5±5.3＊＊ 125.8±5.3＊＊

6 姜黃素及其光敏化對MGC－803 細胞Bcl－2、細胞色素C、Bax 和HSP70 蛋白水平影響

單純姜黃素作用MGC－803 細胞，可使Bcl－2 和HSP70 蛋白表達水平下調(diào)，增加胞漿細胞色素C，對Bax 蛋白水平影響不明顯;而光敏化姜黃素作用于MGC－803 細胞，則可使Bcl－ 2 和HSP70 蛋白表達水平進一步下降，而且胞漿細胞色素C 上升更高，與單純姜黃素作用比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01)，見圖3。

Figure 3. Effects of photoactivated curcumin and curcumin on levels of cytochrome C，Bcl－2，Bax and HSP70 in MGC－803 cells. Con:control;Cur:curcumin;P－Cur:photoactivated curcumin. ±s.n=5. ＊＊P ＜0.01 vs Con;△△P ＜0.01 vs Cur.圖3 光敏化姜黃素與單純姜黃素對MGC－803 細胞中cytochrome C、Bcl－ 2、Bax 和HSP70 水平的影響

討 論

PDT 是近年來興起的利用選擇性蓄積于腫瘤組織的光敏劑在適當波長激光下發(fā)生光敏反應定位殺傷組織細胞的新型腫瘤治療方法［3］。隨著光纖技術、激光醫(yī)學和內(nèi)鏡技術發(fā)展而興起的一種治療惡性腫瘤的新方法，專家預測在2l 世紀光動力治療將成為一種重要醫(yī)療手段。然而現(xiàn)在常用的光敏劑多為卟啉及其衍生物的混合制品、成分復雜、化學結(jié)構不穩(wěn)定、易受生物代謝因素的影響，其光敏損傷作用的程度不易控制，影響療效的穩(wěn)定性。近年來國內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)姜黃素是高效、低毒的新型理想光敏劑［4］。

姜黃素本身具有抗腫瘤、抗炎等多種藥理作用。其作為光敏劑在激光照射后能吸收能量，產(chǎn)生有細胞毒作用的單線態(tài)氧和其它氧自由基等活性氧，這些物質(zhì)和細胞內(nèi)成分發(fā)生光化學反應，誘導細胞凋亡、造成細胞損傷甚至死亡。本研究表明姜黃素在360 ～480 nm 范圍內(nèi)的激光照射具有明顯的PDT 作用。光敏化作用顯著促進姜黃素抑制胃癌MGC－803 細胞的增殖，促進細胞凋亡。從而證實了姜黃素對胃腺癌MGC－803 細胞具有光毒效應。本研究還發(fā)現(xiàn)細胞周期主要阻滯于G0/G1期。有研究表明在日光燈照條件下姜黃素誘導MGC－803 細胞凋亡主要阻滯于G2/M 期［3］，析其原因，可能是與光照條件不一致有關。還有研究表明姜黃素能誘導人胃腺癌BGC－823 細胞、Hep－2 細胞凋亡，使細胞周期阻滯于G0/G1期［5－6］。這說明姜黃素誘導不同的腫瘤細胞，其細胞阻滯的周期有差異。

細胞凋亡是細胞主動參與的自主性死亡過程，可被多種藥物及理化因素誘發(fā)。有研究表明姜黃素能誘導HL－60 細胞凋亡、肺癌NCI－H460 細胞凋亡［7－8］。細胞凋亡程序是一個復雜的、涉及多基因的過程，主要有線粒體和細胞表面受體介導這2 條途徑。有研究表明南海真菌代謝產(chǎn)物1386A 可能通過線粒體途徑誘導MGC－803 細胞凋亡［9］。bcl－2基因家族是研究最為深入的凋亡調(diào)控基因之一，根據(jù)其不同的生物學效應，主要分為以Bax、Bcl－2 和Bid 為代表的3 類蛋白，其中促凋亡蛋白Bax 和抗凋亡蛋白Bcl－2 在細胞凋亡的調(diào)控過程中發(fā)揮著重要作用［10－11］。細胞是否發(fā)生凋亡及凋亡的嚴重程度取決于Bcl－2/Bax 的比值［12］。Bcl－2 家族、線粒體細胞色素C 及caspase 是細胞內(nèi)凋亡信號通路的基本成分［13］。當Bcl－2/Bax 比值降低時，可導致線粒體細胞色素C 的釋放，同時激活凋亡蛋白caspase。Caspase 被認為是哺乳動物細胞凋亡中的關鍵蛋白，一旦活化發(fā)生級聯(lián)反應，凋亡即進入不可逆的階段。而caspase－3 在caspase 家族14 個成員中是最重要的效應型。有研究表明姜黃素通過激活白血病HL60 細胞線粒體途徑的caspase－3 等的降解誘導凋亡［14］。也能夠通過caspase－3 等機制誘導肺癌NCI－H460 細胞凋亡［8］。

有研究表明perifosine 誘導胃癌細胞SGC－7901凋亡與caspase 家族和Bcl－2 家族蛋白的表達密切相關［15］。我們通過Western blotting 分析，姜黃素作用于MGC－803 細胞之后，其抗凋亡蛋白Bcl－2 的表達下調(diào)，而促凋亡蛋白Bax 的表達明顯增加，Bcl－2/Bax 比值顯著降低。同時HSP70 蛋白表達水平下降，細胞色素C 明顯增加。HSP70 能抑制Bcl－2 的表達，起到促凋亡的作用。Bcl－2 抑制線粒體釋放細胞色素C，當Bcl－2 水平下降時，細胞色素C 增加，激活凋亡蛋白caspase，促進凋亡。本實驗發(fā)現(xiàn)凋亡蛋白caspase－3、caspase－8 和caspase－9 的活性明顯增高，線粒體膜電位、活性氧和細胞內(nèi)Ca2+及流式細胞分析儀的結(jié)果均顯示細胞凋亡明顯增加，可推測姜黃素通過下調(diào)Bcl－2，上調(diào)Bax 的表達，激活了caspase－3、caspase－8 和caspase－9 的活性，使其觸發(fā)了凋亡程序，導致MGC－803 細胞凋亡。這對于姜黃素的臨床應用具有重要意義。

綜上所述，光敏化姜黃素主要通過Bcl－2 和線粒體途徑增強其誘導胃癌MGC－803 細胞凋亡作用，其它的凋亡機制還有待進一步研究。

(致謝:承蒙華南師范大學生命激光研究所魏華江教授以及廣東藥學院心血管病研究所亓翠玲教授等的熱心指導和幫助，在此致以衷心的感謝。)

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