ATP 競爭性GSK－3 抑制劑對人食管鱗癌細(xì)胞多藥耐藥的影響*

甘思遠(yuǎn)， 鐘雪云， 謝思明， 羅 楓

(1 廣東醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，廣東 湛江524023;2 暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，廣東 廣州510632;3清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院病理科，廣東 清遠(yuǎn)511518)

目前臨床上對食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous－cell carcinoma，ESCC)主要采用手術(shù)切除結(jié)合術(shù)后放化療的治療方案。隨著腫瘤化療藥物的廣泛應(yīng)用，腫瘤治療過程中產(chǎn)生的耐藥性問題越來越突出，已成為腫瘤聯(lián)合化療失敗的主要原因之一［1］。腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是指腫瘤細(xì)胞對多種具有不同結(jié)構(gòu)和作用靶位的抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥性［2］。研究發(fā)現(xiàn)，ATP 結(jié)合盒(ATP－binding cassette，ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員:ABCB1(ATP－binding cassette，subfamily B，member 1)基因編碼的P 糖蛋白(P－glycoprotein，P－gp)、ABCC2(ATP－binding cassette，subfamily C，member 2)基因編碼的多藥耐藥相關(guān)蛋白2(multidrug resistance－associated protein 2，MRP2)通過水解ATP 獲得能量依賴性的跨膜藥物外排泵的功能，可將抗腫瘤藥物逆濃度從細(xì)胞內(nèi)泵出到細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度并導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)［3－4］。研究發(fā)現(xiàn)抗凋亡蛋白B 細(xì)胞淋巴瘤－2(B－cell lymphoma－2，Bcl－2)蛋白在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，可阻斷多種化療藥物誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡［5］。P－gp、MRP2、Bcl－2 與腫瘤多藥耐藥密切相關(guān)，在腫瘤化療耐藥的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。

Yamada 等［6］發(fā)現(xiàn)，編碼P－gp 的ABCB1 基因是Wnt 通路效應(yīng)元件TCF4/β－catenin 復(fù)合物的一個(gè)直接目的基因，TCF4/β－catenin 途徑的激活可促進(jìn)P－gp 表達(dá)增加。Lim 等［7］研究發(fā)現(xiàn)，將與ATP 競爭糖原合成酶激酶3β (glycogen synthase kinase 3β，GSK－3β)催化活性部位的ATP 競爭性GSK－3 抑制劑6－溴靛玉紅－3＇－肟(6－bromoindirubin－3＇－oxime，BIO)作用于細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致β－catenin、P－gp 和MRP2 的表達(dá)增加，β－catenin 在胞漿及胞核內(nèi)出現(xiàn)累積，P－gp 對其底物的轉(zhuǎn)運(yùn)功能增強(qiáng)，同時(shí)還激活了ABCB1 基因的啟動(dòng)子。

本研究將ATP 競爭性GSK－3 抑制劑BIO 作用于ESCC 細(xì)胞后，檢測β－catenin 與P－gp、MRP2 和Bcl－2 表達(dá)之間的關(guān)系，細(xì)胞內(nèi)游離ATP 水平的改變對P－gp 轉(zhuǎn)運(yùn)功能的影響，研究GSK－3β 活性和細(xì)胞內(nèi)游離ATP 能量水平的改變與ESCC 的MDR的關(guān)系，以期為腫瘤臨床治療尋找新的靶點(diǎn)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 細(xì)胞來源 人類食管鱗癌細(xì)胞系EC－109 由汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院饋贈(zèng)。

1.2 主要試劑 RPMI－1640 培養(yǎng)液購自Gibco;新生胎牛血清購自杭州四季青公司，CY3 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、BCA 法蛋白質(zhì)定量測定試劑盒和ATP 檢測試劑盒均購自上海碧云天公司;鼠抗人MRP2 單克隆抗體購自Abcam;鼠抗人P－gp 單克隆抗體和鼠抗人β－catenin 單克隆抗體和鼠抗人Bcl－2 單克隆抗體均購自Santa Cruz;羅丹明123 染色試劑盒購自南京凱基公司;二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自北京普博欣公司;BIO 購自Sigma。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人類食管鱗癌細(xì)胞EC－109 按常規(guī)方法培養(yǎng)于含10%小牛血清、1 ×105U/L 含青霉素和100 mg/L 鏈霉素的RPMI－1640 培養(yǎng)液完全培養(yǎng)基中，置于5% CO2、37 ℃恒溫密閉式培養(yǎng)箱(相對濕度為95%)內(nèi)，倒置顯微鏡觀察生長情況。約3～4 d 傳代1 次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞處理 EC－109 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)后，取對數(shù)生長期細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，將2.8 ×108/L EC－109 細(xì)胞1 mL 接種到培養(yǎng)瓶中，48 h 后根據(jù)不同組別分別加入2 mL 含不同濃度BIO 藥液的RPMI－1640 培養(yǎng)液或無BIO 藥液的RPMI－1640 培養(yǎng)液，使BIO 的終濃度分別為1 μmol/L 和2 μmol/L，無藥液組為空白對照組(藥物劑量的選擇參考文獻(xiàn)［7－8］)。24 h 后將6 孔板從培養(yǎng)箱內(nèi)取出，倒置顯微鏡下觀察活細(xì)胞形態(tài)。

2.3 免疫熒光細(xì)胞化學(xué) 加入BIO 處理細(xì)胞24 h后取出有細(xì)胞的蓋玻片，PBS 洗5 min ×3 次，丙酮冰上固定細(xì)胞10 min，山羊血清封閉75 min，加入適量按適當(dāng)比例稀釋的Ⅰ抗(MRP2、P－gp、β－catenin 和Bcl－2 抗體的稀釋濃度均為1∶100)，4 ℃冰箱孵育過夜，滴加適量的Cy3 標(biāo)記Ⅱ抗(稀釋比例1∶100)，室溫孵育1 h(避光)，緩沖甘油封片，用PBS 代替Ⅰ抗為陰性對照，其它步驟相同。運(yùn)用專業(yè)CCD 圖像采集系統(tǒng)在顯微鏡下對各實(shí)驗(yàn)組的免疫熒光細(xì)胞化學(xué)結(jié)果隨機(jī)選取5 個(gè)以上的200 倍視野進(jìn)行圖像采集。應(yīng)用Image－Pro Plus 6.0 專業(yè)圖像分析軟件，對所采集的熒光圖片進(jìn)行圖像分析，計(jì)算陽性區(qū)域的平均吸光度(mean absorbance)值;以平均吸光度值代表各蛋白的熒光強(qiáng)度，反映各個(gè)蛋白的表達(dá)情況。

2.4 羅丹明123 染色試劑盒檢測P－gp 轉(zhuǎn)運(yùn)功能

加入BIO 處理細(xì)胞24 h 后常規(guī)消化細(xì)胞脫壁，細(xì)胞懸液離心管內(nèi)離心，各用PBS 洗滌3 次。將細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液重懸于無血清RPMI－1640 培養(yǎng)基中，細(xì)胞計(jì)數(shù)為1 ×109/L。加入羅丹明123 染液，濃度為4 mg/L，37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育20 min。離心后以PBS 洗滌3 次。重懸細(xì)胞于培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)60 min。流式細(xì)胞儀檢測，激發(fā)波長490 nm，發(fā)射波長530 nm;熒光顯微鏡觀察，滴加100 μL 上述混合液于載玻片上，激發(fā)濾光片波長488 nm，阻斷濾光片波長515 nm 觀察，拍照。

2.5 ATP 檢測試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)游離ATP 濃度

加入BIO 處理細(xì)胞24 h 后吸除培養(yǎng)液，以PBS 洗滌3 次。6 孔板每孔加入200 μL 裂解液裂解細(xì)胞，使用細(xì)胞刮刮凈6 孔板上的細(xì)胞，收集細(xì)胞碎片和裂解液于離心管。4 ℃、12 000 ×g 離心10 min，取上清，用于后續(xù)的測定。把ATP 標(biāo)準(zhǔn)溶液用ATP 檢測裂解液稀釋成0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L 濃度梯度。加100 μL ATP 檢測工作液到檢測孔內(nèi)。室溫放置3 ～5 min，以使本底ATP 全部被消耗，從而降低本底。在檢測孔內(nèi)加上50 μL 樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，迅速用微量移液器混勻，間隔2 s 后，立即用酶標(biāo)儀檢測相對發(fā)光單位(relative light unit，RLU)值，同時(shí)用酶標(biāo)儀以562 nm 檢測樣品的吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品所測得的RLU 值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品內(nèi)ATP 的量。BCA 法按試劑盒說明書制作蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品所測得的吸光度計(jì)算樣品內(nèi)蛋白質(zhì)的量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)結(jié)果

與對照組相比，BIO 組β－catenin 和Bcl－2 在胞漿中的表達(dá)增強(qiáng)，并且β－catenin 出現(xiàn)胞核內(nèi)累積(P ＜0.01);MRP2 在胞漿和胞膜中表達(dá)增強(qiáng)(P ＜0.01);P－gp 在胞漿和胞膜中表達(dá)減弱(P ＜0.01)，見圖1、2。

Figure 1. The immunofluorescence cytochemistry showing the expression of MRP2，P－gp，β－catenin and Bcl－2 in EC－109 cells(CY3 staining，×200).圖1 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測EC－109 細(xì)胞內(nèi)β－catenin、Bcl－2、MRP2 和P－gp 的表達(dá)

Figure 2. The mean absorbance of immunofluorescence of β－catenin，Bcl－1，MRP2 and P－gp in ESCC cells. ±s.n=3. ＊＊P ＜0.01 vs control group;▲▲P ＜0.01 vs BIO (1 μmol/L)group.圖2 ESCC 細(xì)胞內(nèi)β－catenin、Bcl－2、MRP2 和P－gp 免疫熒光的平均吸光度值

2 P－gp 對其轉(zhuǎn)運(yùn)底物羅丹明123 的轉(zhuǎn)運(yùn)功能

與對照組相比，1 μmol/L 和2 μmol/L BIO 處理組細(xì)胞內(nèi)羅丹明123 的熒光強(qiáng)度減弱(P ＜0.05)，而這兩組之間無顯著差別(P ＞0.05)，見圖3。

Figure 3. The fluorescence intensity of rhodamine 123 in ESCC cells. ±s.n=4. * P ＜0.05 vs 0 μmol/L.圖3 ESCC 細(xì)胞內(nèi)羅丹明123 的熒光強(qiáng)度

3 ATP 檢測試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)游離ATP 濃度

2 μmol/L BIO 組細(xì)胞內(nèi)游離ATP 濃度高于1 μmol/L BIO 組和對照組(P ＜0.05)，而1 μmol/L BIO 組與對照組之間無顯著差別(P ＞0.05)，見圖4。

Figure 4. The free ATP concentration in ESCC cells. ±s. n =3. * P ＜0.05 vs 0μmol/L or 1 μmol/L.圖4 ESCC 細(xì)胞內(nèi)游離ATP 濃度

討 論

β－catenin 是與細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的Wnt 信號(hào)通路的關(guān)鍵信號(hào)元件。β－catenin 在胞漿和胞核的蓄積是Wnt 通路被激活的標(biāo)志。當(dāng)Wnt 通路被激活時(shí)，GSK－3β 的活性受到抑制，β－catenin 泛素化障礙，β－catenin 在胞漿中累積，并進(jìn)入細(xì)胞核，與淋巴細(xì)胞增強(qiáng)子或T細(xì)胞因子(lymphoid enhancer factor / T cell factor，LEF/TCF)結(jié)合，調(diào)節(jié)目的基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖，對抗凋亡，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展［9］。本研究運(yùn)用GSK－3 抑制劑BIO 處理食管鱗癌EC－109 細(xì)胞后，BIO 組與對照組相比，β－catenin 在胞漿及胞核中的表達(dá)增強(qiáng)，并且β－catenin 在胞核內(nèi)出現(xiàn)累積，與Lim 等［7］和Chang 等［8］的研究結(jié)果相符;提示使用BIO 處理ESCC 細(xì)胞后，GSK－3β 的活性被抑制，導(dǎo)致β－catenin 的降解發(fā)生障礙，從而使β－catenin在細(xì)胞漿及胞核內(nèi)出現(xiàn)累積。而β－catenin 作為TCF/β－catenin 途徑的關(guān)鍵信號(hào)元件，其在胞漿及胞核中的表達(dá)增強(qiáng)，提示TCF/β－catenin 途徑被激活。同時(shí)，運(yùn)用BIO 處理食管鱗癌EC－109 細(xì)胞后，免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的結(jié)果顯示，與對照組相比，加藥組抗凋亡蛋白Bcl－2 在胞漿中的表達(dá)增強(qiáng)。Yan等［10］在ESCC 細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，STAT3 是TCF/β－catenin 途徑的靶基因，隨著β－catenin 在胞漿和胞核內(nèi)的累積，TCF/β－catenin 途徑被激活，從而上調(diào)STAT3 的表達(dá);同時(shí)已有的研究還證實(shí)，bcl－2 是STAT3 的靶基因［11］。因此，本研究運(yùn)用GSK－3 抑制劑BIO 處理食管鱗癌EC－109 細(xì)胞，激活TCF/β－catenin 途徑后，可能上調(diào)EC－109 細(xì)胞內(nèi)STAT3的表達(dá)，從而間接上調(diào)了Bcl－2 的表達(dá)。

本研究運(yùn)用BIO 處理ESCC 細(xì)胞后，與對照組相比，加藥組MRP2 在胞漿和胞膜中表達(dá)增強(qiáng)，與Lim等［7］的研究結(jié)果相符。然而卻意外發(fā)現(xiàn)P－gp 在胞漿和胞膜中表達(dá)減弱，與Lim 等［7］以及Yamada 等［6］的研究結(jié)果不相符;提示在ESCC 細(xì)胞中，BIO 處理ESCC 細(xì)胞激活TCF/β－catenin 途徑后，P－gp 的表達(dá)還受到其它因素的調(diào)控。P－gp 表達(dá)與TCF/β－catenin 途徑的關(guān)系還需繼續(xù)進(jìn)行深入的研究。

本研究運(yùn)用BIO 處理ESCC 細(xì)胞后，分別運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測ESCC 細(xì)胞內(nèi)P－gp 轉(zhuǎn)運(yùn)底物羅丹明123 在細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度以及運(yùn)用ATP 檢測試劑盒檢測ESCC 細(xì)胞內(nèi)游離ATP 水平。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與對照組相比，1 μmol/L 與2 μmol/L BIO 組細(xì)胞內(nèi)羅丹明123 的熒光強(qiáng)度減弱，提示使用BIO處理ESCC 細(xì)胞后，P－gp 對其作用底物的轉(zhuǎn)運(yùn)功能增強(qiáng)，與Lim 等［7］的研究結(jié)果相符。而2 μmol/L BIO組內(nèi)的ESCC 細(xì)胞內(nèi)游離ATP 濃度高于1 μmol/L BIO 組以及對照組的ESCC 細(xì)胞內(nèi)游離A1 μmol/L與2 μmol/L BIO 組TP 濃度，提示2 μmol/L BIO 處理ESCC 細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)游離ATP 水平增加。

1 μmol/L BIO 處理ESCC 細(xì)胞后，P－gp 在胞漿和胞膜中表達(dá)減弱;同時(shí)流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果顯示，P－gp 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)功能增強(qiáng)。但是由于1 μmol/L BIO組細(xì)胞內(nèi)游離ATP 水平與對照組無顯著差別，因此不能判斷是否是因?yàn)槭褂肂IO 處理ESCC 細(xì)胞后，BIO 通過與ATP 競爭GSK－3β 的ATP 結(jié)合位點(diǎn)，在抑制GSK－3β 活性的同時(shí)，通過改變細(xì)胞內(nèi)游離ATP 水平，使ATP 能量依賴性的ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P－gp 的轉(zhuǎn)運(yùn)功能增強(qiáng)。細(xì)胞內(nèi)游離ATP 水平的改變與ATP 能量依賴性的P－gp 蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)功能之間的關(guān)系以及ATP 競爭性GSK－3 抑制劑BIO 對其轉(zhuǎn)運(yùn)功能的調(diào)控機(jī)制還需繼續(xù)進(jìn)行深入的研究。

MRP2、P－gp 和Bcl－2 與腫瘤MDR 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在腫瘤MDR 的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。本研究運(yùn)用BIO 處理ESCC 細(xì)胞后，激活了TCF/β－catenin 通路，增加了MRP2 和Bcl－2 的表達(dá)，增強(qiáng)了P－gp 對其作用底物的轉(zhuǎn)運(yùn)功能，提示BIO 處理ESCC 細(xì)胞后增強(qiáng)了細(xì)胞的MDR。這為進(jìn)一步闡明ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在腫瘤細(xì)胞多藥耐藥中的機(jī)制提供了新的思路。

［1］ Falasca M，Linton KJ. Investigational ABC transporter inhibitors［J］. Expert Opin Investig Drugs，2012，21(5):657－666.

［2］ Wind NS，Holen I. Multidrug resistance in breast cancer:from in vitro models to clinical studies［J］. Int J Breast Cancer，2011，2011:967419.

［3］ Sun YL，Patel A，Kumar P，et al. Role of ABC transporters in cancer chemotherapy［J］. Chin J Cancer，2012，31(2):51－57.

［4］ Sodani K，Patel A，Kathawala RJ，et al. Multidrug resistance associated proteins in multidrug resistance［J］. Chin J Cancer，2012，31(2):58－72.

［5］ Patel MP，Masood A，Patel PS，et al. Targeting the Bcl－2［J］. Curr Opin Oncol，2009，21(6):516－523.

［6］ Yamada T，Takaoka AS，Naishiro Y，et al. Transactivation of the multidrug resistance 1 gene by T－cell factor 4/beta－catenin complex in early colorectal carcinogenesis［J］. Cancer Res，2000，60(17):4761－4766.

［7］ Lim JC，Kania KD，Wijesuriya H，et al. Activation of β－catenin signalling by GSK－3 inhibition increases p－glycoprotein expression in brain endothelial cells［J］. J Neurochem，2008，106(4):1855－1865.

［8］ Chang HW，Roh JL，Jeong EJ，et al. Wnt signaling controls radiosensitivity via cyclooxygenase－2－mediated Ku expression in head and neck cance［J］. Int J Cancer，2008，122 (1):100－107.

［9］ Lam AP，Gottardi CJ. β－catenin signaling:a novel mediator of fibrosis and potential therapeutic target［J］. Curr Opin Rheumatol，2011，23(6):562－567.

［10］ Yan S，Zhou C，Zhang W，et al. β－catenin/TCF pathway upregulates STAT3 expression in human esophageal squamous cell carcinoma［J］. Cancer Lett，2008，271(1):85－97.

［11］ Huang S，Chen M，Shen Y，et al. Inhibition of activated Stat3 reverses drug resistance to chemotherapeutic agents in gastric cancer cells［J］. Cancer Lett，2012，315(2):198－205.