巨尾桉葉中皂苷的提取分離及其抗氧化活性研究

黃 增，劉雄民，黃麗葵，陳華玲，黃紅銘

廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，南寧530004

桉樹屬樹種有900余種，其中巨尾桉(Eucalyptus grandis x E.urophylla)是巨桉和尾葉桉雜交的速生樹種，為我國(guó)主要種植樹種之一。桉屬植物有效成分的研究集中在揮發(fā)油成分［1-3］。亦有文獻(xiàn)［4］指出，藍(lán)桉等多種桉屬植物中含有三萜類皂苷。陳婷等［5］對(duì)桉葉中抗菌有效部位進(jìn)行了初步研究，陳海等［6］指出桉葉中多酚具有抗氧化性。但有關(guān)巨尾桉葉中皂苷的提取純化工藝仍未受到足夠重視。本文以水為溶劑，開(kāi)展從巨尾桉葉中提取純化皂苷的工藝研究，探討提取物中皂苷的含量對(duì)抗氧化性的影響，為巨尾桉葉的開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

巨尾桉桉葉:采摘于廣西大學(xué)校園。

齊墩果酸、石油醚、抗壞血酸、雙氧水、三羥甲基氨基甲烷、鄰苯三酚、二苯基苦基肼自由基(DPPH)、濃鹽酸等，以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司); UV-2550紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 皂苷的提取

新鮮桉葉經(jīng)水洗烘干后粉碎，過(guò)60目篩。稱取一定量的原料，用適量石油醚在70℃水浴中回流3 h脫除葉綠素，自然揮發(fā)溶劑至干，加入適量水，于一定溫度條件下浸提后，離心，上層清液用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，將提取液濃縮后干燥，得到皂苷粗提物。

1.3.2 皂苷的分離純化

1.3.2.1 有機(jī)溶劑萃取法純化

將粗提液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，用等體積的乙醚溶液萃取3次，水飽和的正丁醇萃取6次，將上層正丁醇相合并并且濃縮，得到皂苷純化液，測(cè)定皂苷含量。

1.3.2.2 大孔樹脂吸附法分離純化

通過(guò)靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)，篩選出對(duì)皂苷具有較好純化效果的HPD300型樹脂，稱取100 g經(jīng)過(guò)預(yù)處理的HPD300型樹脂，濕法裝柱，室溫下將濃度為6.76 mg/mL的粗提液以1.00 mL/min的流速通過(guò)大孔樹脂柱，待樹脂吸附飽和后，用蒸餾水洗柱至流出液無(wú)色，用2倍上樣量體積的90%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮，測(cè)定含量。

1.3.2.3 大孔樹脂-丙酮沉淀聯(lián)用分離法

對(duì)粗提液進(jìn)行離心后，過(guò)0.50 μm膜進(jìn)行大孔樹脂上柱前預(yù)處理。稱取100 g經(jīng)過(guò)預(yù)處理的HPD300型樹脂，濕法裝柱，室溫下將濃度為6.76 mg/mL的提取液以1.00 mL/min的流速通過(guò)大孔樹脂柱，樹脂吸附飽和后，蒸餾水洗柱至流出液無(wú)色，用2倍上樣量體積的70%乙醇洗脫，減壓濃縮洗脫液，再加以少量的甲醇溶解，緩慢加入丙酮，將產(chǎn)生的沉淀離心后棄取上層清液，多次沉淀直到上清液基本無(wú)色。用適量去離子水溶解，干燥即可回收純度較高的皂苷。

1.3.3 皂苷的分析方法

1.3.3.1 皂苷的定性分析方法

采用皂苷的泡沫反應(yīng)、與乙酸酐-濃硫酸的顏色反應(yīng)、紫外可見(jiàn)吸收光譜和液相色譜進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.3.3.2 皂苷含量的測(cè)定

按文獻(xiàn)［7］的方法，采用香草醛-高氯酸顯色分光光度法，以A548nm對(duì)齊墩果酸濃度(X)進(jìn)行線性回歸分析，求得線性方程為Y=2847.7X-0.0326，相關(guān)系數(shù)R2=0.9989。取一定體積的皂苷提取液按該方法測(cè)定吸光值，用線性方程計(jì)算提取液中皂苷含量。

1.3.4 皂苷的抗氧化性能

配制一定皂苷濃度的桉葉粗提液、大孔樹脂純化液和大孔樹脂吸附-丙酮沉淀純化液，同時(shí)以抗壞血酸(VC)作為對(duì)比液。按照文獻(xiàn)［8］的方法，分別測(cè)定各溶液對(duì)DPPH自由基、過(guò)氧化氫以及超氧陰離子自由基的清除作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 巨尾桉葉中皂苷的定性分析

2.1.1 皂苷的泡沫反應(yīng)［9］

取樣品適量，加入少量水溶解并煮沸10 min左右，將提取液于試管中強(qiáng)烈振搖，提取液有蜂窩狀泡沫產(chǎn)生，并持續(xù)15 min以上，而空白對(duì)照液產(chǎn)生的泡沫在1 min內(nèi)消失，該實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象表明存在皂苷。

2.1.2 皂苷的顏色反應(yīng)［10］

取樣品適量，溶于乙酐中，緩慢滴加1滴濃硫酸，觀察到溶液由黃色變成紅色，之后變成淺綠色，最后逐漸褪去顏色，該實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象表明存在三萜類皂苷。

2.1.3 皂苷的紫外可見(jiàn)光譜及液相色譜特性

圖1 試樣的紫外可見(jiàn)光(a)及HPLC(b)色譜分析圖譜Fig.1 UV absorption(a)and HPLC(b)spectrum of samples

紫外可見(jiàn)光光譜如圖1(a)所示。經(jīng)過(guò)香草醛-高氯酸顯色后，齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品與純化樣品在548 nm處均有較強(qiáng)吸收。液相色譜特性如圖1(b)所示，在色譜檢測(cè)條件為:色譜柱Kromasil-100A C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇:水=95∶5，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，流速0.80 mL/min，柱溫30℃。此條件下齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品與樣品出峰時(shí)間基本一致，推斷樣品中可能有三萜類皂苷物質(zhì)。

2.2 提取條件對(duì)皂苷得率的影響

2.2.1 提取溫度對(duì)皂苷得率的影響

稱取10 g經(jīng)預(yù)處理的桉葉粉，加入適量水使得液料比為20∶1，設(shè)置提取時(shí)間為6 h?？疾鞙囟确謩e在30、40、50、60和70℃下對(duì)皂苷得率的影響。由圖2(a)可知，隨著溫度的升高，皂苷的得率增大。這是因?yàn)闇囟壬呤沟梅肿拥臒徇\(yùn)動(dòng)加劇，細(xì)胞壁受到破壞致使內(nèi)部的皂苷浸出。為避免消耗更多能量，提取溫度以60℃為宜。

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)皂苷得率的影響

稱取10 g經(jīng)預(yù)處理的桉葉粉，加入適量水使得液料比為20∶1，設(shè)置提取溫度為60℃，考察提取時(shí)間分別在2、3、4、5和6 h下對(duì)皂苷得率的影響。由圖2(b)可知，隨著提取時(shí)間的增加，皂苷得率逐漸增大，之后皂苷的得率幾乎不變，這可能是由于一方面皂苷在提取5 h已經(jīng)充分溶出了。另一方面，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，皂苷可能少部分降解了。綜合考慮，浸提時(shí)間選擇為5 h。

2.2.3 提取液料比對(duì)皂苷得率的影響

稱取10 g經(jīng)預(yù)處理的桉葉粉，設(shè)置提取溫度60℃，提取時(shí)間為5 h，考察提取液料比分別為12∶1、16∶1、20∶1、24∶1和28∶1下對(duì)皂苷提取得率的影響。由圖2(c)可知。隨著液料比的增大，皂苷的溶出率也在增大。當(dāng)液固比大于20∶1時(shí)，皂苷得率增加幅度不大。從保證提取效果和降低濃縮負(fù)荷方面綜合考慮，液料比以20∶1為宜。

圖2 提取溫度(a)、提取時(shí)間(b)、液料比(c)對(duì)巨尾桉皂苷得率的影響Fig.2 The effect of extraction time(a)，extraction temperature(b)and ratio of liquid to solid(c)on yield of saponin

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化回流提取的工藝

根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，通過(guò)單因素試驗(yàn)，選取提取溫度、提取時(shí)間、提取液料比這3個(gè)對(duì)桉葉皂苷得率影響較為顯著的因素，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法優(yōu)化皂苷的提取工藝，如表1所示。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 Factor level and coded of Box-Behnken design

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Box-Behnken design matrix and response value for the yield of saponin

1 1 0 -1 1 4.0 5 1 2 0 1 1 4.1 0 1 3 0 0 0 5.5 5 1 4 0 0 0 5.6 0 1 5 0 0 0 5.4 2 1 6 0 0 0 5.4 0 1 7 0 0 0 5.5 1

以皂苷得率為響應(yīng)值(Y)，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。試驗(yàn)中，1～12是析因試驗(yàn);13～ 17是中心點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn)用來(lái)估計(jì)試驗(yàn)誤差。

應(yīng)用Design Expert軟件，對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，選擇對(duì)響應(yīng)值顯著的各項(xiàng)，可得桉樹葉水提液中皂苷的得率對(duì)提取溫度、提取時(shí)間和料液比的二次多項(xiàng)回歸方程為:Y=5.500+0.160A+ 0.025B+0.061C+0.025AB+0.003AC+0.025BC-0.450A2-0.750B2-0.720C2。

對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，桉樹葉水提液中皂苷提取回歸分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 ANOVA for the response surface quadratic polynomial model

對(duì)回歸方程進(jìn)行檢驗(yàn)，相關(guān)系數(shù)R2=0.9942，P＜0.0001，表明回歸模型顯著，擬和程度好。對(duì)系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)(表3)，由F值可判定對(duì)指標(biāo)影響的顯著性依次為A＞C＞B即溫度＞料液比＞時(shí)間，優(yōu)化后得到的最佳工藝條件為:提取溫度61.81℃、提取時(shí)間5.02 h，液料比為20.09∶1，在此條件下桉葉中皂苷的得率為5.51%。

2.4 巨尾桉葉中的皂苷分離純化結(jié)果

表4 三種不同分離純化方法的純化效果Table 4 The purification effect comparison of different methods

由表4可知，經(jīng)有機(jī)溶劑萃取純化后，桉葉中皂苷的含量由16.22%提高到20.11%。其回收率為54.34%，此方法需要消耗較多的溶劑，純化周期較長(zhǎng)，但純度較低。經(jīng)過(guò)HPD300樹脂一次純化后可得到為含量為 31.64%的皂苷，其回收率為72.18%，周期較短，回收率也較高，但純度較低。而采用大孔樹脂-丙酮沉淀聯(lián)用分離法可得到為含量為50.35%的皂苷，其回收率為65.41%，純度較高。

2.5 皂苷抗氧化性質(zhì)研究

2.5.1 皂苷清除DPPH自由基的測(cè)定

為確定各試樣對(duì)DPPH·的清除效果，考察各試樣在0.01至0.60 mg/mL濃度范圍內(nèi)的清除率。由圖3(a)可知，在較低濃度時(shí)，抗壞血酸、粗提物、大孔樹脂純化物和大孔樹脂吸附-丙酮沉淀純化物對(duì)DPPH·均有較高的清除率。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，粗提物和大孔樹脂純化物均在濃度為0.50 mg/ mL時(shí)有最大清除率，分別為83.02%和84.20%。大孔樹脂吸附-丙酮沉淀純化物在濃度為0.60 mg/ mL時(shí)有最大清除率，為85.62%。

2.5.2 皂苷清除過(guò)氧化氫(H2O2)的測(cè)定

為確定各試樣對(duì)H2O2的清除效果，考察各試樣在0.01至0.50 mg/mL濃度范圍內(nèi)對(duì)H2O2的清除率。由圖3(b)結(jié)果可知，粗提物對(duì)H2O2的清除效果較明顯，兩種純化物對(duì)H2O2的清除效果稍低。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，粗提物、大孔樹脂純化物和大孔樹脂吸附-丙酮沉淀純化物均是在濃度為0.50 mg/ mL時(shí)有最大清除率，其清除率分別為80.10%、55.02%和48.21%。

圖3 不同濃度試樣對(duì)DPPH·(a)、H2O2(b)和O(c)的清除曲線Fig.3 DPPH free radical(a)，Hydrogen peroxide(b)and Superoxide anion radical(c)scavenging rates of different samples

3 結(jié)論

3.1 進(jìn)行了巨尾桉葉有效成分的定性鑒定，結(jié)果表明，巨尾桉葉中所含的皂苷為三萜類皂苷。

3.2 進(jìn)行了皂苷提取工藝優(yōu)化研究，確定提取巨尾桉葉中皂苷的較優(yōu)條件為:提取溫度61.81℃、提取時(shí)間5.02 h，液料比為20.09∶1，在此條件下皂苷的得率為5.51%。

3.3 對(duì)粗皂苷進(jìn)行了分離純化方法的探索，采用溶劑萃取法、大孔樹脂吸附法以及大孔樹脂吸附-丙酮沉淀聯(lián)用分離法分別對(duì)桉葉水提液進(jìn)行分離純化，經(jīng)過(guò)對(duì)比得出較優(yōu)的分離方法為大孔樹脂吸附-丙酮沉淀聯(lián)用法。該方法可得到含量為50.35%的皂苷，其回收率為65.41%。

3.4 開(kāi)展了對(duì)桉葉提取物的抗氧化性能研究，結(jié)果指出，提取物對(duì)DPPH·有明顯的清除作用，隨著皂苷含量的增大，對(duì)DPPH·的清除率也相應(yīng)增大，但未見(jiàn)顯著差異;在清除H2O2和O體系中，隨著試樣中皂苷含量的增加，試樣對(duì)H2O2和O清除能力有所下降，由此可知巨尾桉中皂苷對(duì)H2O2和的清除作用不顯著。

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