基于響應(yīng)面法從連翹葉中提取連翹酯苷A和連翹苷的工藝優(yōu)化

劉偉霞，楊建雄

1陜西師范大學(xué)物理學(xué)與信息技術(shù)學(xué)院;2陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西安710062

連翹葉是木犀科植物連翹 Forsythia suspense (Thunb.)Vahl的干燥葉，具有清熱解毒、抗菌、保肝、降血脂、抗氧化及抗衰老等作用［1-5］，主要含有連翹苷、連翹酯苷、蘆丁、齊墩果酸、熊果酸、右旋松脂酚等化學(xué)成分［6］。其中連翹苷具有抗氧化和降血脂的作用，對于預(yù)防動脈粥樣硬化和冠心病等疾病有一定功效［7］;連翹酯苷具有抑制彈性蛋白酶活性，治療肺氣腫等多種疾病的功效［8］，是迄今為止從連翹屬植物中發(fā)現(xiàn)的抗菌活性最強(qiáng)的成分之一。近年來的研究發(fā)現(xiàn)連翹葉中的連翹苷、連翹酯苷A的含量高于果實(shí)［3］，且2010版中國藥典規(guī)定連翹苷和連翹酯苷A的含量為連翹藥材的質(zhì)控指標(biāo)［9］。我國的連翹葉資源豐富，價(jià)格低廉，有效提取其生物活性物質(zhì)，可提高連翹葉的經(jīng)濟(jì)附加值。為開發(fā)和利用豐富的連翹葉資源，研究人員已分別開展了連翹苷和連翹酯苷A提取的工藝研究工作［10-12］。但是，從連翹葉中復(fù)合提取這兩種活性物質(zhì)的工藝研究尚未見報(bào)道。

響應(yīng)面分析法是一種優(yōu)化工藝條件的有效方法［13］，與傳統(tǒng)的正交實(shí)驗(yàn)相比，響應(yīng)面分析法具有試驗(yàn)周期短，效率高，能在整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的區(qū)域上給出因素與響應(yīng)值之間的回歸方程、因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值。本文利用響應(yīng)面法優(yōu)化從連翹葉中同時(shí)提取連翹酯苷A和連翹苷的工藝條件，以期為連翹葉的進(jìn)一步開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Shimadzu HPLC-20A vp型高效液相色譜儀系統(tǒng)(日本島津)，Sartorius BP221S電子天平，KQ-300DE型數(shù)控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，TU-1810紫外-可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52AA(上海亞榮生化儀器廠)，Milli-QG超純水制備儀(美國Millipore公司)。

1.2 試劑

連翹葉2011年5月采自陜西師范大學(xué)校園內(nèi)，由生命科學(xué)學(xué)院植物學(xué)教研室田先華教授鑒定。連翹酯苷A(批號:A0590～20 mg)和連翹苷(批號: A0272～20 mg)對照品均購自成都曼斯特公司，含量均在98%以上。甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定方法的建立

色譜條件:大連依利特色譜柱Hypersil BDS C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相為甲醇(A)-水(含0.2%冰醋酸)(B)，梯度洗脫:0～7 min，28%～38%A;7～11 min，38%～40%A;11～25 min，40%～60%A;25～30 min，60%A，測定波長235 nm，流速l mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL。此條件下對照品及及樣品的色譜圖見圖1。色譜峰的理論板數(shù)按連翹酯苷峰計(jì)算在5000以上。

對照品溶液的制備:精密稱取連翹酯苷A對照品和連翹苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL含連翹酯苷A 0.576 mg和連翹苷0.270 mg的混合溶液。

樣品溶液的制備:稱取連翹葉粉末1 g，置三角瓶中，于不同條件下浸泡提取，放冷，抽濾，取樣液1 mL，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50℃蒸干，加入50%甲醇10 mL，超聲溶解，再經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液待用。

標(biāo)準(zhǔn)曲線:精密吸取上述對照品溶液1、2、4、6、8、10、12 μL分別進(jìn)樣測定，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量X為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為:

連翹酯苷A:Y=812084X－12006，R2=0.9999。表明連翹酯苷A濃度在0.576～6.912 μg內(nèi)線性關(guān)系良好。

連翹苷:Y=840808X+8539.7，R2=0.9999。表明連翹苷濃度在0.27～3.24 μg內(nèi)線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn):取同一混合對照品溶液重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積，計(jì)算連翹酯苷 A的 RSD為0.30%(n=5)，連翹苷的RSD為0.54%(n=5)，說明該方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一混合對照品溶液在10 h之內(nèi)每間隔2 h測定一次，記錄峰面積，計(jì)算得連翹酯苷A的RSD為1.48%(n=6)，連翹苷的RSD為0.44%(n=6)，說明對照品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn):在相同條件下，將同一批樣品制成5份樣品溶液，分別測定含量，計(jì)算得連翹酯苷A的RSD為1.20%，連翹苷的RSD為0.80%(n=5)，說明該方法重復(fù)性好。

圖1 樣品(a)及混合對照品(b)的色譜圖Fig.1 Chromatogram of sample(a)and mixture standards(b) 1.Forsythiaside;2.Phillyrin

2.2 單因素試驗(yàn)對連翹酯苷A和連翹苷的提取率影響

五月份采摘連翹葉［14］，于鼓風(fēng)干燥箱干燥24 h后粉碎，按照上述含量測定項(xiàng)測定濾液中連翹酯苷A和連翹苷的含量，計(jì)算提取率。

提取率=提取所得目標(biāo)物質(zhì)的量/連翹葉的干重× 100%

2.2.1 乙醇濃度

固定提取時(shí)間為60 min，浸提溫度60℃，液料比為25∶1，考察乙醇濃度(10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%)對連翹酯苷A和連翹苷得率的影響，連翹酯苷A的提取率分別為3.47%、4.63%、5.16%、5.76%、6.18%、6.19%、6.21%，連翹苷的提取率分別為1.27%、1.87%、2.07%、2.51%、2.71%、2.81%、2.96%。當(dāng)乙醇濃度大于50%，連翹酯苷A的提取率變化不大，連翹苷的提取率提高幅度較小，并且隨著乙醇濃度的提高，雜質(zhì)溶出率也增多，故綜合考慮，本試驗(yàn)選擇50%乙醇為提取溶劑。

2.2.2 浸提溫度

采用50%乙醇為提取溶劑，液料比為25∶1提取60 min，考察浸提溫度(40，50，60，70，80，90℃)對連翹酯苷A和連翹苷提取率的影響。隨著溫度的升高，連翹酯苷A的提取率先增后減，分別為5.94%、6.67%、7.28%、8.00%、7.95%、7.27%，連翹苷的提取率逐漸增加，分別為2.21%、2.58%、2.77%、2.89%、2.90%、2.97%。可能的原因是連翹酯苷A分子中具有酯鍵，較高溫度下易水解，從而影響提取率。另外，溫度越高雜質(zhì)溶出量也越多，故綜合考慮連翹酯苷A的穩(wěn)定性以及能源節(jié)約，選取70℃為提取溫度。

2.2.3 液料比

采用50%乙醇為提取溶劑，70℃浸提60 min，考察液料比(10∶1，15∶1，20∶1，25∶1，30∶1)對連翹酯苷A和連翹苷提取率的影響，連翹酯苷A的提取率分別為4.88%、6.11%、6.61%、7.43%、7.36%，連翹苷的提取率分別為2.00%、2.39%、2.66%、2.98%、3.09%?？梢?，液料比為25∶1時(shí)，連翹酯苷A和連翹苷的提取率均達(dá)到較高，故液料比選用25∶1。

2.2.4 浸提時(shí)間

采用50%乙醇為提取溶劑，浸提溫度70℃，液料比為25∶1，考察浸提時(shí)間(30，60，90，120，150 min)對連翹酯苷A和連翹苷提取率的影響，連翹酯苷A的提取率分別為7.42%、7.76%、7，78%、7.81%、7.65%，連翹苷的提取率分別為2.73%、2.88%、2.90%、2.93%、2.92%。浸提時(shí)間超過60 min則連翹酯苷A和連翹苷的提取率均增減很少。150 min時(shí)連翹酯苷A還略有降低，可能是連翹酯苷A不穩(wěn)定，因水解而降低了提取率，故浸提時(shí)間選擇60 min。

2.3 響應(yīng)面分析法優(yōu)化工藝條件［15］

2.3.1 響應(yīng)面模型建立

根據(jù)Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理［16］，綜合單因素試驗(yàn)考察結(jié)果，采用 Design-Expert 8.0.5b軟件為輔助手段設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)因素和水平見表1。

表1 Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)因素及水平表Table 1 Factors and levels of BBD combination experiment

對A(液料比)、B(乙醇濃度)、C(浸提時(shí)間)、D (浸提溫度)四個(gè)因素做以下變換:X1=(A－25)/ 5，X2=(B－50)/10，X3=(C－60)/30，X4=(D－70)/10，以X1、X2、X3、X4為自變量，以連翹酯苷A提取率(Y1)和連翹苷提取率(Y2)為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0.5b進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.3.2 響應(yīng)面結(jié)果

共設(shè)計(jì)29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，1～24號為析因?qū)嶒?yàn)，25～29號為中心試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)結(jié)果見表2。利用Design-Expert 8.0.5b軟件對表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到以連翹酯苷A提取率(Y1)和連翹苷提取率(Y2)為響應(yīng)值的二次多項(xiàng)回歸方程為:

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Box-Behnken Design matrix and experimental results of forsythiaside yield and phillyrin yields from F.suspense leaves

6.7 8 2.8 7 9 -1 0 0 -1 6.0 5 2.5 1 1 0 1 0 0 -1 6.6 6 2.6 7 1 1 -1 0 0 1 6.5 5 2.7 4 1 2 1 0 0 1 7.3 5 3.0 0 1 3 0 -1 -1 0 6.3 5 2.5 7 1 4 0 1 -1 0 6.8 0 2.9 8 1 5 0 -1 1 0 6.4 9 2.5 9 1 6 0 1 1 0 6.8 6 3.0 4 1 7 -1 0 -1 0 6.3 2 2.5 6 1 8 1 0 -1 0 7.2 1 2.9 1 1 9 -1 0 1 0 6.4 8 2.7 2 2 0 1 0 1 0 7.0 8 2.8 2 2 1 0 -1 0 -1 5.9 4 2.2 2 2 2 0 1 0 -1 6.2 4 2.7 1 2 3 0 -1 0 1 6.4 3 2.5 4 2 4 0 1 0 1 6.8 8 2.8 9 2 5 0 0 0 0 7.2 9 2.9 0 2 6 0 0 0 0 7.2 2 2.9 2 2 7 0 0 0 0 7.2 0 2.8 1 2 8 0 0 0 0 7.2 5 2.8 6 8 0 0 1 1 2 9 0 0 0 0 7.2 8 2.8 8

2.3.3 回歸模型方差分析

二次多項(xiàng)回歸模型方程擬合可靠性由 R2表達(dá)，其統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性由F值檢驗(yàn)，影響因素的線性效應(yīng)、平方效應(yīng)及其交互效應(yīng)的顯著性由模型系數(shù)的P值檢驗(yàn)。分別對連翹酯苷A提取率和連翹苷提取率的回歸模型及各參數(shù)的顯著度進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見表3a和表3b。

表3 a 連翹酯苷A回歸模型方差分析Table 3 a Analysis of variance for Forsythiaside regression model

注:＊＊P＜0.001，*P＜0.05。下同。Note:＊＊P＜0.001;*P＜0.05.The same below.

由表3a可知，該模型的P＜0.0001，說明模型回歸高度顯著?；貧w方程的相關(guān)系數(shù)(R2)為0.9900，說明模型響應(yīng)值的變化99.00%來自所選考察變量，因此，回歸方程可以較好地描述考察因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系。其中液料比、乙醇濃度、浸提溫度對連翹酯苷A提取率的影響最大，浸提時(shí)間對連翹酯苷A提取率的影響最小。模型的一次項(xiàng)X1， X2，X4極顯著，X3不顯著;二次項(xiàng)均極顯著;交互項(xiàng)X1X2極顯著，X1X3顯著，其余不顯著，這表明各影響因素對于連翹酯苷A提取率的影響不是簡單的線性關(guān)系。失擬度的P值為0.1337＞0.05，對連翹酯苷A提取率影響不顯著，說明該模型的擬合度較好。可以利用該模型確定最佳工藝條件。

表3 b 連翹苷回歸模型方差分析Table 3 b Analysis of variance for phillyrin regression model

由表3b可知，該模型的P＜0.0001，說明模型回歸高度顯著?；貧w方程的相關(guān)系數(shù)(R2)為0.9490，說明模型響應(yīng)值的變化94.90%來自所選考察變量。因此，回歸方程可以較好地描述考察因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系。其中液料比、乙醇濃度、浸提溫度對連翹苷提取率的影響最大，浸提時(shí)間對連翹苷提取率的影響最小。模型的一次項(xiàng)X1，X2，X4極顯著，X3不顯著;二次項(xiàng)X21、X22、X24顯著，X23不顯著;交互項(xiàng)均不顯著，這表明各影響因素對于連翹苷提取率的影響不是簡單的線性關(guān)系。失擬度的P值為0.1435＞0.05，對連翹苷得率影響不顯著，說明該模型的擬合度較好，可以利用該模型確定最佳工藝條件。

2.3.4 響應(yīng)面圖分析

利用Design Expert軟件進(jìn)行分析兩兩考察因素間交互作用的響應(yīng)面圖，如圖2～3所示，可直觀反應(yīng)各因素和響應(yīng)值及各考察因子之間的交互作用，由圖2知，影響連翹酯苷A提取率的兩兩因素間交互作用比較顯著，而從圖3可知，影響連翹苷提取率的兩兩因素間交互作用不顯著。響應(yīng)面圖全部開口向下，隨著每個(gè)因素值的增大，響應(yīng)值增大，當(dāng)響應(yīng)值增大到極值后，又隨著因素值的增大逐漸減少，從響應(yīng)面的最高點(diǎn)和等高線可看出在所選的范圍內(nèi)存在極值，即該模型有穩(wěn)定點(diǎn)，且穩(wěn)定點(diǎn)是最大值。模型預(yù)測最優(yōu)工藝條件為:液固比30 mL/g，乙醇濃度52.88%，浸提時(shí)間53.28 min，溫度74.35℃。

2.4 最優(yōu)條件的驗(yàn)證

為了檢驗(yàn)上述模型方程的合適性和有效性，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。按照響應(yīng)面數(shù)據(jù)并根據(jù)實(shí)際條件得出最佳工藝條件:液固比為30 mL/g，乙醇濃度為53%，浸提時(shí)間為53 min，溫度為74℃。分別提取了3批樣品，經(jīng)HPLC法測定連翹酯苷A的提取率分別為7.52%、7.58%、7.57%，平均提取率為7.56%，與模型的預(yù)測值(7.53%)的相對誤差為0.4%。連翹苷的提取率分別為3.02%、3.28%、2.96%，平均提取率為3.09%，與模型的預(yù)測值(3.03%)相對誤差為2.0%?？梢娫撃Ｐ涂梢暂^好地反映出乙醇提取連翹酯苷A和連翹苷的條件。

3 結(jié)論

連翹苷和連翹酯苷A含量是我國藥典規(guī)定的連翹藥材的質(zhì)控指標(biāo)，也是連翹具有抗病毒抗氧化作用的重要活性組分，所以選擇上述兩種物質(zhì)作為指標(biāo)物質(zhì)可以較為全面的反映連翹的品質(zhì)。根據(jù)這兩種活性物質(zhì)的理化性質(zhì)，以及單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，二者的提取條件具有一致性，故可同時(shí)以二者的提取率為響應(yīng)值尋求最佳工藝條件。

響應(yīng)面法能更好地處理離散的水平值，能夠更為準(zhǔn)確地找出各因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值。本試驗(yàn)通過利用響應(yīng)面法研究從連翹葉中提取連翹酯苷A和連翹苷的最佳工藝，得到最佳工藝條件為:液固比為30 mL/g，乙醇濃度為53%，浸提時(shí)間為53 min，溫度為74℃。該工藝提取率高，穩(wěn)定性好，操作簡便，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

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