槲皮素的熱降解機(jī)理及其分解動(dòng)力學(xué)研究

郭滿滿，肖卓炳，彭密軍，于華忠，郭瑞軻

吉首大學(xué)林產(chǎn)化工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，張家界427000

槲皮素(quercetin)又名櫟精，槲皮黃素，化學(xué)名為3，5，7，3'，4'-五羥基黃酮，分子量為302.23，屬于植物雌激素，是具有類雌激素效應(yīng)的天然化合物，具有很高的藥用價(jià)值。它是一些中草藥的有效成分，如菟絲子、桑寄生、筋骨草、毛耳草、蒲黃、白花敗醬草、葫蘆巴、荔枝、魚腥草等中都含有豐富的槲皮素［1］，藥典記載槲皮素是瓦松、銀杏葉的主要成分。近年來，有關(guān)槲皮素的研究很多，其中在雌激素相關(guān)性疾病研究最多，主要包括乳腺癌、骨質(zhì)疏松、前列腺癌、宮頸癌等疾?。?，3］。在這些疾病研究中，槲皮素主要表現(xiàn)為誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化，調(diào)控體內(nèi)雌激素代謝，對(duì)腫瘤黏附、侵襲、血管形成各過程都有影響［4-6］。與其他黃酮類藥物藥理作用相比，槲皮素有其獨(dú)特性。它是許多中藥材的有效成分之一，又是某些成藥的質(zhì)量指標(biāo)。槲皮素應(yīng)用非常廣泛，主要為醫(yī)藥、日用化工和食品等行業(yè)。國內(nèi)外對(duì)其藥理、提取、分離純化、含量檢測(cè)等均有大量研究，但未見有對(duì)其熱解機(jī)理及其動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究。

研究藥物的熱穩(wěn)定性和熱降解過程對(duì)藥物的穩(wěn)定性改進(jìn)和存放期評(píng)價(jià)以及藥物生產(chǎn)、開發(fā)決策控制有很大的現(xiàn)實(shí)意義和指導(dǎo)意義。而熱分析技術(shù)是研究化合物熱穩(wěn)定性的重要手段［7-9］。為此，本研究應(yīng)用TG-DTG技術(shù)來研究槲皮素的熱分解行為，協(xié)同使用Kissinger法［10］、Ozawa法［10］、Achar法［10］和Coats-Redfern法［11］來推導(dǎo)其最可能的熱分解機(jī)理，并求出相關(guān)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品(由成都?xì)W康植化科技有限公司提供，純度為99.0%)

1.2 熱重分析

熱分析實(shí)驗(yàn)在德國NETZSCH公司生產(chǎn)的STA 409 PC/TG-DTG型熱分析儀上進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)分別采用不同升溫速率(5、10、15 K/min)在室溫至700℃進(jìn)行動(dòng)態(tài)升溫實(shí)驗(yàn)，試樣用量控制在10 mg左右，以高純度氮?dú)?99.99%)為載氣，流量為40 mL/min，系統(tǒng)自動(dòng)采集數(shù)據(jù)，得到樣品的TG-DTG曲線。

1.3 熱分析動(dòng)力學(xué)方法

1.3.1 多重升溫速率法

(1)Kissinger法:

式中Tp為DTG曲線的峰溫值，Eα為表觀活化能，單位為kJ/mol，A為指前因子，單位為min-1，R為氣體常數(shù)［單位J/(mol·K)］，β為升溫速率。

分別分析多個(gè)TG-DTG曲線，取出β對(duì)應(yīng)的Tp。求出各個(gè) lnβ/和1/Tp。利用lnβ/對(duì)1/Tp作圖，經(jīng)最小二乘法線性擬合可得到動(dòng)力學(xué)參數(shù)Eα、lnA和相關(guān)系數(shù)(r)。

(2)Ozawa法:

式中g(shù)(α)是最概然機(jī)制函數(shù)的積分形式，T是熱力學(xué)溫度，其他各符號(hào)的意義同上。

利用lgβ對(duì)1/T作圖，依據(jù)最小二乘法用自編程序?qū)緮?shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸，得動(dòng)力學(xué)參數(shù)Eα及r。

1.3.2 單一升溫速率法

(1)Coats-Redfern法:

以ln［g(α)/T2］對(duì)1/T作圖，采用最小二乘法進(jìn)行線性回歸可得到一條直線，從截距l(xiāng)n(AR/βEα)和斜率(-Eα/RT)可求算出活化能Eα和指前因子A。

(2)Achar法:

式中，f(α)是微分形式機(jī)理函數(shù)，其它各符號(hào)的意義同上文。

以ln［(dα/dt)/f(α)］對(duì)1/T作圖，采用最小二乘法擬合數(shù)據(jù)，從直線截距l(xiāng)nA和斜率(-Eα/RT)可求算出活化能Eα和指前因子A。

將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)T、轉(zhuǎn)化率α、轉(zhuǎn)化速率dα/dt用積分法Coats-Redfern方程和微分法Achar方程結(jié)合常用40種機(jī)理函數(shù)［12］，計(jì)算出Eα、lnA和線性相關(guān)系數(shù)r。當(dāng)線性相關(guān)性較好(r接近于1)，且兩種方法所得Eα和lnA最為接近，而且活化能與多速率掃描法處理結(jié)果一致時(shí)，所對(duì)應(yīng)的機(jī)制函數(shù)即為該反應(yīng)最可能的反應(yīng)機(jī)制函數(shù)，相應(yīng)的Eα和A即為該反應(yīng)的活化能和指前因子。

本實(shí)驗(yàn)首先應(yīng)用多重升溫速率法求出反應(yīng)的活化能Eα，再應(yīng)用單一升溫速率法(結(jié)合多重升溫速率法求出的Eα)推測(cè)出最可能的熱分解反應(yīng)機(jī)制。

1.4 分子鍵級(jí)模擬

采用ChemOffice中的ChemDraw軟件繪制化合物分子結(jié)構(gòu)并在Chem3D中進(jìn)行結(jié)構(gòu)能量最小優(yōu)化，然后運(yùn)用Gaussian量子化學(xué)軟件，采用Hartree-Fock從頭計(jì)算法，在HF/3-21G*水平下計(jì)算分子鍵級(jí)，計(jì)算精度和收斂閥值取程序內(nèi)定值，全部計(jì)算工作均在微機(jī)上完成［13］。

2 結(jié)果與討論

2.1 槲皮素的熱降解機(jī)理推斷

圖1為槲皮素分子的主要鍵級(jí)，圖2為槲皮素在10℃/min下測(cè)定的熱分析曲線(其他升溫速率下與此相似)。

化合物的熱分解分兩步完成:第一步從57℃到180℃，根據(jù)鍵級(jí)大小推斷斷裂的化學(xué)鍵可能是C2-O10、C9-O10，C13-O17，結(jié)合失重率10.02%推斷此步失重是失去兩個(gè)O原子，理論失重率10.58%與之相吻合;第二步從180℃到402℃，根據(jù)槲皮素的鍵級(jí)強(qiáng)弱推斷，可能是剩余分子中C12-O18鍵斷裂和C9-C15鍵斷裂，結(jié)合失重率25.43%推斷此步只失去一個(gè)苯環(huán)，18-OH基團(tuán)在斷裂之后與9號(hào)鍵相連，理論失重率25.81%與之相吻合。

由表1可知，隨著升溫速率的增大，槲皮素的熱分解溫度也隨著增大。說明隨著升溫速率的增大，槲皮素沒有隨之在同一溫度下分解，槲皮素的熱降解是一個(gè)緩慢的過程，由于溫度快速升高致使槲皮素沒有迅速達(dá)到完全快速的熱傳遞，造成分子有效碰撞(分子動(dòng)能)也隨之向后推移。由于第二步之后分解比較復(fù)雜，不是簡(jiǎn)單的熱分解過程，且殘留的物質(zhì)較少，所以只對(duì)前兩步分解反應(yīng)進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析。

表1 不同升溫速率下的DTG峰溫Table 1 Peak temperatures of DTG curves at different heating rates

2.2 槲皮素的熱分解動(dòng)力學(xué)

2.2.1 多速率法求取動(dòng)力學(xué)參數(shù)

5、10、15℃/min 3種不同升溫速率下，多速率Kissinger和Ozawa法計(jì)算標(biāo)題化合物兩步熱分解在TG-DTG曲線所取的數(shù)據(jù)見表1。根據(jù)方程可求得動(dòng)力學(xué)參數(shù)，見表2。

表2 采用Kissinger法和Ozawa法求得的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 Kinetic parameters by Kissinger and Ozawa method

2.2.2 熱分解機(jī)制函數(shù)的推斷

采用β為10℃/min的TG-DTG曲線作為單速率法的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。Achar法和Coats-Redfern法同時(shí)進(jìn)行，相互印證。對(duì)兩步失重的單速率法計(jì)算時(shí)，數(shù)據(jù)見表3。

表3 采用Achar、Coats-Redfern法計(jì)算所需的兩步失重?cái)?shù)據(jù)(β=10℃/min)Table 3 Two-stage weightlessness data by Achar and Coats-Redfern methods(β=10℃/min)

將數(shù)據(jù)T、α、dα/dt用積分法Coats-Redfern方程和微分法Achar方程結(jié)合常用40種機(jī)制函數(shù)，計(jì)算出Eα、lnA和r(表4)。當(dāng)線性相關(guān)性較好，兩種方法所得Eα和lnA最為接近，且活化能與多速率掃描法處理結(jié)果一致時(shí)，所對(duì)應(yīng)編號(hào)的機(jī)制函數(shù)即為該反應(yīng)最可能的反應(yīng)機(jī)制函數(shù)，相應(yīng)的Eα和A即為該反應(yīng)的活化能和指前因子。

表4 采用Coats-Redfern、Achar法求得的具有較好線性相關(guān)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)(β=10℃/min)Table 4 Linearly dependent kinetic parameters by Achar and Coats-Redfern methods(β=10℃/min)

2.2.3 動(dòng)力學(xué)參數(shù)確定

將表2與表4結(jié)果對(duì)比可知，第一步失重機(jī)制函數(shù)為16號(hào)，第二步為36號(hào)時(shí)，線性相關(guān)性較好(r接近于1)，兩種方法所得Eα和lnA最為接近，并且由Achar與Coats-Redfern方程計(jì)算出的Eα和lnA與Ozawa法和Kissinger法計(jì)算的結(jié)果較為接近。

表5 兩步分解的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 5 Kinetic datas for the two-stage weightlessness

表5比較了在不同方法所得動(dòng)力學(xué)參數(shù)?？梢源_定第一步熱分解為隨機(jī)成核與隨后生長控制機(jī)制，符合Avrami-Erofeev方程，Eα=95.69 kJ/mol，lnA=28.61，f(α)=1-α，g(α)=-ln(1-α);第二步熱分解為化學(xué)反應(yīng)控制機(jī)制，符合反應(yīng)級(jí)數(shù)方程，Eα=286.99 kJ/mol，lnA=56.07，f(α)=(1-α)2，g(α) =(1-α)-1-1。

2.3 槲皮素貯存期的推斷

根據(jù)求算得到的第一步分解Eα和A，則在一定反應(yīng)溫度Tc下的反應(yīng)速率常數(shù)k=Ae-Ea/RTc，進(jìn)一步求算得到不同貯存溫度下對(duì)應(yīng)的反應(yīng)速率常數(shù)k和負(fù)對(duì)數(shù)值pk。在貯存溫度下，根據(jù)藥品pk值和藥品商品規(guī)定貯存期的相關(guān)性［14］，即pk＜3.5的區(qū)間內(nèi)，貯存期不到1年;4＜pk＜7.5的區(qū)間內(nèi)，貯存有效期為1.5～2年;在7.5＜pk＜11的區(qū)間內(nèi)，貯存有效期為3年;pk＞10.5的區(qū)間內(nèi)，貯存有效期為4～5年。不同溫度對(duì)應(yīng)的貯存期對(duì)應(yīng)的結(jié)果如下表所示。

表6 不同溫度下槲皮素的貯存期Table 6 The shelflife of quercetin at different temperatures

由表6可知，槲皮素在室溫下貯存期為1.5～2年，經(jīng)推斷溫度與其貯存有直接關(guān)系，建議在較低溫度下(低于-60℃)貯存槲皮素，以便于更長久的使用。

3 結(jié)論

升溫速率的變化對(duì)槲皮素的熱失重有明顯的影響，隨著升溫速率的升高，樣品的起始分解溫度和終止分解溫度均向高溫移動(dòng)，最大失重速率溫度也隨之升高。

通過熱分析曲線，可知槲皮素的失重分兩步，將單速率法——Achar法(微分法)和Coats-Redfern法(積分法)求得的結(jié)果，與多速率法——Kissinger法和Ozawa法的結(jié)果相互驗(yàn)證，基本一致。因此，通過熱分析及其動(dòng)力學(xué)方法來研究中藥活性成分的熱穩(wěn)定性及其動(dòng)力學(xué)參數(shù)是可行的，多種單速率法和多速率法相互印證更能確保結(jié)果的可靠性。

經(jīng)Gaussian模擬和熱重?cái)?shù)據(jù)結(jié)合分析，槲皮素在第一步分解時(shí)，失去2個(gè)O原子;第二步分解時(shí)失去一個(gè)苯環(huán);槲皮素第一步熱分解(即熱失效)表觀活化能Eα=95.69 kJ/mol，lnA=28.61，微分機(jī)理函數(shù)f(α)=1-α，積分機(jī)理函數(shù)g(α)=-ln(1-α)。

根據(jù)第一步熱分解的動(dòng)力學(xué)參數(shù)推斷在室溫(25℃)下，槲皮素的貯存期為1.5～2年，建議在較低溫度下(低于-60℃)貯存槲皮素，以便于更長久的使用。此結(jié)果可以為目前大量含槲皮素藥品的質(zhì)量監(jiān)控和評(píng)價(jià)提供依據(jù)。本文所用熱分析動(dòng)力學(xué)方法，分析操作過程簡(jiǎn)便、快捷，僅需要微量(毫克級(jí))樣品，且可以得到各步分解過程的模型機(jī)理函數(shù)，這些優(yōu)勢(shì)都是傳統(tǒng)的傳統(tǒng)初均速率法分析藥物穩(wěn)定性所不具備的。

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