我國黃酒釀造微生物的研究進展

我國黃酒釀造微生物的研究進展

劉 程1，謝廣發(fā)2，3，孫劍秋1，*，鄒慧君2，3，王睿麒1，3，錢 斌2，3，臧 威1，周建弟2，3，壽凰蓉1，白逢彥4（1.紹興文理學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江紹興312000；2.國家黃酒工程技術(shù)研究中心，浙江紹興312000；3.浙江古越龍山紹興酒股份有限公司，浙江紹興312000；4.中國科學(xué)院微生物研究所真菌學(xué)國家重點實驗室，北京100101）

對黃酒的浸米漿水、酒藥、酒母、酒曲、酒醪中微生物資源和其他米酒微生物資源的研究進展進行綜述，并總結(jié)了黃酒微生物育種技術(shù)的發(fā)展成果?；谖覈S酒微生物的研究現(xiàn)狀，利用現(xiàn)代生物技術(shù)提升黃酒微生物的研究水平，全面、深入和系統(tǒng)地研究黃酒微生物資源、多樣性、系統(tǒng)發(fā)育、生態(tài)分布、釀造功能、菌種選育及其環(huán)境微生物對黃酒生產(chǎn)的影響等諸多課題，對于我國黃酒產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有重要理論意義和應(yīng)用價值。

黃酒，微生物，育種

黃酒（Chinese rice wine）是源于中國的世界三大著名古酒之一［1］，具有酒精度低、酒性醇厚、營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨特、品種多樣等特點［2］。我國的黃酒生產(chǎn)主要集中在江浙滬地區(qū)，尤其以糯米為主要原料、用鑒湖水釀造的優(yōu)質(zhì)紹興酒，最能夠代表現(xiàn)代黃酒工業(yè)的發(fā)展水平。

黃酒采用邊糖化邊發(fā)酵的“雙邊發(fā)酵”技術(shù)生產(chǎn)，在釀造過程中淀粉酶的糖化功能與酵母菌的發(fā)酵特性平衡作用，保證了糖化與發(fā)酵兩個過程相互協(xié)調(diào)、同時進行［3-4］?！半p邊發(fā)酵”過程，就是由各種微生物完成的生物化學(xué)反應(yīng)過程。在微生物酶的催化下，釀酒原料被降解并轉(zhuǎn)化形成酒精及其他各種風(fēng)味成分，微生物酶的生物催化功能在黃酒生產(chǎn)中具有極其重要的作用，直接關(guān)系到釀酒的產(chǎn)量和質(zhì)量［5］。黃酒釀造過程中復(fù)雜的物質(zhì)變化，幾乎都是在不同微生物產(chǎn)生的各種酶系作用下完成。黃酒釀造與許多其他傳統(tǒng)釀造食品一樣都屬于開放式發(fā)酵［6］，即使接種純種微生物，在發(fā)酵過程中也不可避免的會有

外來微生物侵入，因此多種微生物混菌發(fā)酵是黃酒釀造微生物作用的基本特點?？墒蔷驼麄€生產(chǎn)過程來說，其中一些主要微生物類群發(fā)揮主導(dǎo)作用。

追根溯源，我國黃酒釀造技術(shù)擁有5000年以上悠久發(fā)展史［7］，但是關(guān)于黃酒的科學(xué)認知僅有近50年的時間［1］。黃酒釀造技術(shù)基礎(chǔ)理論研究的不足，困擾著我國黃酒工業(yè)生產(chǎn)水平的提升。本文對我國黃酒微生物方面的現(xiàn)有研究成果進行綜述，對進一步深入開展黃酒微生物的基礎(chǔ)研究具有積極意義。

1 與黃酒有關(guān)的微生物

1.1 浸米漿水中的微生物

黃酒釀造包括篩米、浸米、蒸飯、落缸、前酵、后酵、壓榨、煎酒和貯存等諸多環(huán)節(jié)［8］，其中浸米是黃酒正式發(fā)酵前的重要步驟。通過浸米，可以使大米吸水膨脹以利于蒸煮，并獲得酸性米漿水［9］。在傳統(tǒng)紹興酒工藝中，米漿水作為投料用水被回收用于黃酒釀造［10］。一般認為，米漿水中氨基酸、維生素等可以被酵母菌細胞利用，而其中多種有機酸使發(fā)酵在最初階段即具有一定的原始酸度，可以抑制雜菌生長，保證酵母菌的正常發(fā)酵。毛青鐘等［11］發(fā)現(xiàn)，米漿水內(nèi)微生物種類極其豐富，包括細菌、酵母菌和霉菌等類群；漿水中的有機酸（絕大部分是乳酸）主要是由乳酸桿菌發(fā)酵產(chǎn)生［12］。如果漿水中優(yōu)勢細菌的種類發(fā)生變化，可能對黃酒發(fā)酵過程產(chǎn)生影響［13］。

1.2 黃酒酒藥中的微生物

傳統(tǒng)黃酒酒藥又稱小曲、白藥、酒餅，是以秈米等作為主要原料，在適宜的條件下培養(yǎng)后自然發(fā)酵而成的黃酒釀造用糖化發(fā)酵劑，具有糖化發(fā)酵力強、用藥量少、方法簡單、易于保存、使用方便等優(yōu)點。比較有代表性的酒藥，包括紹興酒藥、寧波酒藥、蘇州甜酒藥、上海崇明“八二曲”、常州曲藥等［14］。在我國南方的一些小型黃酒企業(yè)或農(nóng)村，通常使用傳統(tǒng)酒藥釀制黃酒［5］。酒藥內(nèi)蘊含的豐富菌種資源（表1）主要源于陳藥粉接種，保證優(yōu)良菌株代代相傳［15］。本課題組曾對浙江紹興的古越龍山、會稽山、塔牌、沈永和、女兒紅及鑒湖等六個品牌酒藥樣本內(nèi)酵母菌資源進行系統(tǒng)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)扣囊復(fù)膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera）在六個品牌黃酒酒藥內(nèi)的分布占有絕對優(yōu)勢［16］。

1.3 黃酒酒母中的微生物

黃酒是一種含有酒精的發(fā)酵酒，需要大量酵母菌的參與來完成釀造過程，酵母菌的數(shù)量和質(zhì)量對于黃酒釀造特別重要［18］。酒母，即“黃酒之母”，是由少量酵母菌逐漸擴大培養(yǎng)后制成的酵母醪液，可以為黃酒釀造提供所需要的大量酵母菌細胞的發(fā)酵劑。酒母在黃酒發(fā)酵醪液內(nèi)繁殖的過程中，產(chǎn)生酒精并可以形成一些影響黃酒質(zhì)量的風(fēng)味物質(zhì)，所以說沒有酒母就沒有黃酒。淋飯酒母是紹興黃酒生產(chǎn)中非常重要的酒母類型，淋飯酒母制作過程中微生物變化復(fù)雜［19］，主要涉及酵母菌、乳酸菌和一些霉菌（表2）。

1.4 黃酒酒曲中的微生物

酒曲是以小麥、大米等糧食或麩皮等糧食副產(chǎn)物作為主要原料，在適當?shù)乃莺蜏囟葪l件下培養(yǎng)后，制成的含有大量具有糖化和發(fā)酵功能的各種微生物及其有關(guān)活性酶的糖化發(fā)酵劑。在黃酒釀造過程中，酒曲內(nèi)的微生物或活性酶主要發(fā)揮糖化功能，將釀酒原料中的淀粉分解為葡萄糖，供酵母菌發(fā)酵利用而產(chǎn)生酒精；在制曲過程中形成的曲香及其積累的代謝產(chǎn)物，對于黃酒風(fēng)格的形成起著十分重要的作用［5］。自然培養(yǎng)的酒曲內(nèi)種類豐富，其中的真菌類群對于酒曲的糖化功能至關(guān)重要，所以近年來人們比較重視酒曲內(nèi)真菌多樣性的研究（表3）。江南大學(xué)陸健研究組采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法和RISA、DNA序列分析等技術(shù)，對紹興黃酒麥曲中的真菌組成進行了比較深入的分析［20-24］；于麗娟等［25］研究了南通白蒲黃酒麥曲中真菌群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與紹興黃酒麥曲中真菌種群差異較大。據(jù)此，也可推測，不同地域生產(chǎn)的麥曲生產(chǎn)特性可能存在差異，進而影響黃酒的釀造質(zhì)量與產(chǎn)品風(fēng)格。

表1 黃酒酒藥中的微生物Table1 The microorganisms in the xiaoqu of ricewine

表2 黃酒酒母中的微生物Table2 The microorganisms in the yeast starter of ricewine

表3 黃酒酒曲中的微生物Table3 The microorganisms in the jiuqu of ricewine

續(xù)表

1.5 黃酒醪液中的微生物

我國黃酒釀造技術(shù)具有悠久的發(fā)展歷史，不同地區(qū)的黃酒生產(chǎn)形成了各自的釀造方法和獨特風(fēng)格［3］。黃酒釀造屬于開放式發(fā)酵，主要源于酒曲、酒母及其他生產(chǎn)環(huán)境或工具設(shè)備的各種微生物類群存在于醪液內(nèi)（表4），主導(dǎo)完成糖化和發(fā)酵過程中發(fā)生的極其復(fù)雜的物質(zhì)變化。一般認為，酒曲提供的霉菌主要發(fā)揮糖化作用，源于酒母的酵母菌具有重要的發(fā)酵活性，但是近年來關(guān)于黃酒微生物的研究結(jié)果表明，黃酒醪液內(nèi)細菌尤其是乳酸菌類群可能對黃酒生產(chǎn)的順利進行具有重要影響，而且對黃酒風(fēng)味的形成也起到一定作用［28-30］。

表4 黃酒醪液中的微生物Table4 The microorganisms in the mash of ricewine

續(xù)表

1.6 米酒中的微生物

米酒又稱甜酒，一般以優(yōu)質(zhì)米為主要原料，經(jīng)過微生物的酸化、糖化、酒化和酯化等一系列生化過程及其代謝的協(xié)調(diào)作用釀制而成，營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨特、甘飴可口［36］。米酒作為我國古老的酒種之一，在我國南北方均有釀造，尤其以湖北孝感等地的米酒最為有名?；诿拙频尼勚乒に嚺c產(chǎn)品特性等，各地的米酒均應(yīng)該屬于傳統(tǒng)發(fā)酵型黃酒范疇［37］。向文良等［36］利用AFLP指紋圖譜技術(shù)對四川傳統(tǒng)米酒發(fā)酵過程中原核微生物演替規(guī)律進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著酒曲的接入米酒醅中原核微生物伴隨米酒理化因子的動態(tài)變化而發(fā)生群落演替。各種有益微生物是米酒釀造的決定因素，酒香主要來源于各種微生物的混合發(fā)酵，菌種（表5）間的相互作用、組成比例及其代謝關(guān)系、代謝產(chǎn)物等，對米酒的質(zhì)量和風(fēng)味都有著直接影響［38］。

2 黃酒微生物選育

微生物育種技術(shù)是提高產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量、增加產(chǎn)品類型的重要手段［41］，我國的黃酒企業(yè)及相關(guān)技術(shù)人員一直重視黃酒微生物的選育工作。黃酒生產(chǎn)用微生物菌株與其他工業(yè)微生物一樣，主要有兩個來源，從釀酒樣本中分離篩選得到即選種或者對保藏菌株進行遺傳改良獲得即育種。

由于黃酒企業(yè)的研發(fā)基礎(chǔ)比較薄弱，通過對研發(fā)條件要求較低的傳統(tǒng)分離篩選方法獲得優(yōu)良生產(chǎn)菌株的菌種選育技術(shù)，是企業(yè)人員優(yōu)先考慮的技術(shù)方向。謝廣發(fā)等［42］采用TTC法、CO2失重法并結(jié)合釀酒實驗，從淋飯酒母中分離篩選到快速發(fā)酵的釀酒酵母GY-9，用于機械化黃酒生產(chǎn)能夠提高成品酒的酒精度、縮短發(fā)酵周期。高永強等［43］將分離自會稽山的香雪酒中酵母菌，經(jīng)過酵母水實驗、錐型瓶發(fā)酵、耐酒精、耐高溫、速釀酒母制作和錐型瓶模擬大缸發(fā)酵實驗等，篩選到了耐高酒精度、耐高濃度糖的酵母菌株。糖化菌對于黃酒釀造原料的生物轉(zhuǎn)化非常重要，為豐富純種麥曲糖化菌種資源，從紹興多個黃酒企業(yè)的生麥曲中分離篩選到幾株米曲霉SJM-1、SJM-2、SJM-3、SJM-4，與普遍應(yīng)用的蘇-16相比較，糖化力和液化力更高、釀酒性能更好［44］。由于傳統(tǒng)分離篩選方法操作簡單、易于應(yīng)用，企業(yè)外的研究人員對這項技術(shù)也比較關(guān)注。張建煒等［45］通過不同單倍體菌株耐受能力比較和黃酒發(fā)酵酒樣中殘?zhí)?、酒精度及乙酸乙酯和異戊醇含量分析，篩選出了優(yōu)良的黃酒酵母遺傳育種單倍體。楊魯君等［46］從古越龍山麥曲、酒藥、發(fā)酵醪中分離到52株真菌，通過比較菌株的耐乙醇和滲透壓能力，篩選出抗逆性強的釀酒酵母F-18，該菌株起酵速度快，對糖的轉(zhuǎn)化利用能力高，而總酸、高級醇等含量適中。從古越龍山漿水、酒藥和酒曲內(nèi)分離篩選出一株植物乳桿菌，能快速提高米漿水酸度，縮短浸米時間并抑制雜菌生長，而且可以有效地降低浸米水中生物胺含量［47］。

基于自發(fā)突變原理，從釀酒樣本中可以分離篩選得到優(yōu)良菌株。但是，誘變育種卻可以使黃酒微生物的突變頻率以幾何級數(shù)增加。誘變育種技術(shù)若與高效的篩選技術(shù)結(jié)合，可以大大提高育種工作效率。以不產(chǎn)生毒素的黃曲霉為原始菌株，經(jīng)過紫外線與LiC1復(fù)合誘變、碳酸鋇誘發(fā)及自然分離方法選育到一株突變株，糖化酶和液化酶活力分別比親株提高103.46%和65.08%，釀酒性能更好，而且生產(chǎn)性狀能夠穩(wěn)定遺傳［48］。潘麗軍等［49］對黑曲霉出發(fā)菌株進行紫外誘變、紫外線與LiC1復(fù)合誘變處理，篩選到一株高產(chǎn)糖化酶的正向突變株，產(chǎn)酶活力提高73.63%，而且該菌株的耐酸、耐酒精性能良好；連續(xù)傳代8次后，產(chǎn)酶活力沒有顯著差異，具有良好的酶活穩(wěn)定性?？梢詰?yīng)用于黃酒微生物誘變的理化因素很多，但是因為紫外線（UV）等可以引起染色體畸變的誘變劑不易回復(fù)突變［50］，安全簡便，是工業(yè)微生物誘變育種的最常用方法。

表5 米酒中的微生物Table5 The microorganisms in ricewine

近年來，黃酒研究人員已經(jīng)認識到，傳統(tǒng)分離篩選方法的選種效率低，而誘變的育種勞動強度大，現(xiàn)代生物技術(shù)的迅速發(fā)展可能明顯提升我國黃酒微生物育種的研究水平。趙然然等［51］采用長側(cè)翼同源PCR法（LFH-PCR）構(gòu)建基因敲除組件，然后把敲除組件轉(zhuǎn)入黃酒酵母細胞中，利用同源重組機制精確敲除精氨酸酶基因（CAR1）構(gòu)建黃酒酵母工程菌株，敲除CAR1基因工程菌酒液中尿素含量降低72%，氨基甲酸乙酯含量降低了38%，并且該菌株的遺傳穩(wěn)定性好，發(fā)酵性能與出發(fā)菌株基本一致。根據(jù)申超等［52］報道，采用融合PCR技術(shù)，將DUR3基因置于強啟動子PGKlp后構(gòu)建過表達組件“URA3-PGKlp-DUR3-PGK1t-URA3”，轉(zhuǎn)化工業(yè)黃酒酵母單倍體Na（MATa），獲得單倍體工程菌所釀黃酒發(fā)酵液中尿素含量降低了55%，氨基甲酸乙酯含量降低10.9%?；蚬こ碳夹g(shù)在減低黃酒中氨基甲酸乙酯產(chǎn)生，構(gòu)建尿素吸收型工業(yè)黃酒酵母工程菌方面已經(jīng)取得一定成績。但是，考慮到食品安全問題，以基因工程為代表的現(xiàn)代生物育種手段可能會在黃酒微生物選育工作中受到限制和制約［1］，適應(yīng)進化（Adaptive evolution）策略是黃酒生產(chǎn)菌株育種的重要發(fā)展方向［53］。

3 總結(jié)與展望

關(guān)于我國黃酒微生物的研究已經(jīng)取得一定成績，可是與白酒等其他飲料酒微生物研究相比較，還存在明顯差距［54］。許多關(guān)于黃酒微生物的研究結(jié)果還不夠深入，或者由于技術(shù)方法比較落后而直接導(dǎo)致研究結(jié)果可能存在偏差甚至錯誤，目前的研究成果遠不能滿足黃酒行業(yè)跨越發(fā)展對科技進步的需求。盡管RISA、DNA序列分析及其基因敲除等分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)開始運用于黃酒微生物的研究中［23-24，51］，但是利用現(xiàn)代生物技術(shù)，提升黃酒微生物的研究水平，全面、深入和系統(tǒng)地研究黃酒微生物資源、多樣性、系統(tǒng)發(fā)育、生態(tài)分布、釀造功能、菌種選育及其環(huán)境微生物對黃酒生產(chǎn)的影響等諸多課題，對于我國黃酒產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展仍然具有重要理論意義和應(yīng)用價值。

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Research progress on the microorganisms of Chinese ricewine

LIU Cheng1，XIE Guang-fa2，3，SUN Jian-qiu1，*，ZOU Hui-jun2，3，WANG Rui-qi1，3，QIAN Bin2，3，ZANG Wei1，ZHOU Jian-di2，3，SHOU Huang-rong1，BAI Feng-yan4
（1.College of Life Sciences，Shaoxing University，Shaoxing 312000，China；2.National Engineering Research Center for Chinese Rice Wine，Shaoxing 312000，China；3.Zhejiang Guyuelongshan Shaoxing Rice Wine Co.，Ltd.，Shaoxing 312000，China；4.State Key Laboratory of Mycology，Institute of Microbiology，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101，China）

The research progresses of microbial resources in seriflux，xiaoqu，yeast starter，jiuqu，fermentation broth of Chinese ricewine and other ricewines were reviewed and the development results of microbial breeding technology in Chinese ricewine were concluded.In order to enhance the research level of microbiologies in Chinese ricewine，using modern biotechnologies to study the microbial resources，diversity，phylogenesis，ecological distribution，brewing function and breeding in Chinese ricewine and other environmental microbiologies which should have an impact on Chinese ricewine production.The study must be comprehensive，in-depth and systematical.It had important theoretical significance and application value on healthy development of Chinese ricewine industry.

Chinese ricewine；microorganism；breeding

TS201.1

A

1002-0306（2016）08-0374-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.070

2015－10－08

劉程（1993-），男，大學(xué)本科，研究方向：環(huán)境微生物技術(shù)，E-mail：185819840@qq.com。

*通訊作者：孫劍秋（1969-），男，博士，教授，研究方向：釀酒微生物技術(shù)，E-mail：jianqius@163.com。

國家自然科學(xué)基金青年基金項目（31500020）；中國科學(xué)院微生物研究所真菌學(xué)國家重點實驗室開放課題（SKLMKF201307）；浙江省重大科技專項（2013C02006-1）；浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動計劃暨新苗人才計劃（2015R428006）；紹興市公益性技術(shù)應(yīng)用研究計劃項目（2014B70042）。