氯化鋰對人骨肉瘤細(xì)胞U2-OS增殖、凋亡及Fas、Caspase-3 mRNA表達(dá)的影響

趙意華，陳清漢 ，華海嬰，姜玉軍，秦建英，任明明

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科 鄭州450014 2)鄭州大學(xué)醫(yī)藥科學(xué)研究院 鄭州450052

#通訊作者，男，1963年5月生，碩士，教授，研究方向:骨科疾病的基礎(chǔ)與臨床，E-mail:chenqinghan833@medmail.com.cn

骨肉瘤是一種起源于間葉組織的惡性腫瘤，好發(fā)于兒童和青少年股骨遠(yuǎn)端、脛骨近端，易轉(zhuǎn)移至肺、腦等組織［1］，因而愈后較差。研究［2］表明，其發(fā)生機(jī)制主要與原癌基因激活和抑癌基因失活有關(guān)。目前臨床治療方法以手術(shù)結(jié)合多種藥物化療［3］為主，但常用化療藥物如順鉑(PDD)、大劑量環(huán)磷酰胺(HDMTX)長期應(yīng)用副作用較大，效果不理想。鋰是一種人體非必需微量元素，具有免疫調(diào)節(jié)作用，并在體內(nèi)外具有廣譜抗腫瘤作用; 其化合物氯化鋰(LiCl)在體外可抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡［4］。目前，LiCl 對人骨肉瘤細(xì)胞系(U2-OS)作用的研究尚未見文獻(xiàn)報道。作者觀察了LiCl 在體外對U2-OS 細(xì)胞增殖、凋亡及Fas、Caspase-3 mRNA 表達(dá)的影響，探討其可能的作用機(jī)制，為骨肉瘤的藥物治療尋求新的途徑。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器 U2-OS、LiCl、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期檢測試劑盒(鄭州創(chuàng)生生物公司)，DMEM 培養(yǎng)基(Gibco 公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，胰蛋白酶、MTT(Sigma 公司)，酶標(biāo)儀(Thermo 公司)，流式細(xì)胞儀(Benekman 公司)。以GAPDH 為內(nèi)參照。精密稱取1.695 g LiCl 溶于20 mL 三蒸水中，配制成2.0 mol/L 母液，過濾后4℃保存?zhèn)溆茫R用時加入培養(yǎng)基稀釋至終濃度。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) U2-OS 細(xì)胞貼壁生長于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d 傳代1 次。

1.3 實驗分組 取對數(shù)生長期U2-OS 細(xì)胞，胰酶消化后調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×105mL－1，接種于培養(yǎng)板內(nèi)，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h 后棄去舊液，分組培養(yǎng)，每組設(shè)5 個平行孔。正常對照組用等容積培養(yǎng)液培養(yǎng)，陽性對照組加用15 mg/L 5-FU，藥物組分別加入40、80、150 mmol/L LiCl 溶液。

1.4 觀測指標(biāo)

1.4.1 細(xì)胞增殖抑制率 細(xì)胞分別培養(yǎng)24、48 和72 h 后，加MTT(5 mg/L)20 μL，培養(yǎng)4 h 后棄去培養(yǎng)液，加200 μL DMSO，待結(jié)晶顆粒充分溶解后，在酶標(biāo)儀490 nm 處測定吸光度(A)，根據(jù)公式計算細(xì)胞增殖抑制率:增殖抑制率=(1 －實驗組A/對照組A)×100%。

1.4.2 凋亡和細(xì)胞周期 取各組細(xì)胞接種于6 孔板內(nèi)培養(yǎng)，48 h 后收集細(xì)胞于1.5 mL EP 管內(nèi)，加500 μL Annexin-binding Buffer 重懸細(xì)胞并調(diào)整濃度為(1.0～5.0)×106mL－1，加Annexin V-FITC 5 μL、PI 10 μL，避光染色5 min 后，上流式細(xì)胞儀檢測凋亡;加PI(50 mg/L)1 mL，4℃避光染色30 min，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

1.4.3 Fas、Caspase-3 mRNA 檢測 各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后用PBS 清洗，之后冰上操作，Trizol 法提取RNA，按照試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物行PCR 擴(kuò)增。PCR 引物由上海生工生物工程公司合成。Fas 后引物序列5’-GCCACCCCAAGTAGATCT GG-3’，前引物序列 5’-ACTGTGACCCTTGCAC CAAAT-3’; Caspase-3 后引物序列5’-GCATACT GTTTCAGCATGGCAC-3 ’，前引物序列 5 ’-CAAACTTTTTCAGAGGGGATCG-3’。PCR 反應(yīng)條件:預(yù)變性94℃(GAPDH)或98℃(Caspase-3 和Fas)5 min; 變性94℃30 s，退火58℃(GAPDH)或54℃(Caspase-3)或59℃(Fas)30 s，延伸72℃45 s，總循環(huán)35 次(GAPDH)或34 次(Fas 和Caspase-3)。反應(yīng)結(jié)束后取PCR 產(chǎn)物5 μL，行瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描，以目的條帶與GAPDH 條帶灰度值的比值表示目的基因mRNA的相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0 處理數(shù)據(jù)，應(yīng)用單因素方差分析比較各組細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞周期、凋亡率及Fas、Caspase-3 mRNA 相對表達(dá)量，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 LiCl 對U2-OS 細(xì)胞增殖的影響 增殖抑制率測定結(jié)果見表1。

表1 5組增殖抑制率測定結(jié)果(n=5)%

2.2 LiCl 對U2-OS 細(xì)胞周期和凋亡的影響 結(jié)果見表2。

2.3 LiCL 對U2-OS 細(xì)胞中Fas、Caspase-3 mRNA 表達(dá)的影響 結(jié)果見表3。

表2 4組U2-OS 細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡率(n=5)

表3 4組Fas 和Caspase-3 mRNA 的相對表達(dá)量(n=3)

3 討論

研究［5-6］發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展涉及細(xì)胞內(nèi)許多基因的改變，而某些基因的表達(dá)在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤生長方面具有重要意義［7-8］，其中Fas/FasL 和Caspase 系統(tǒng)在細(xì)胞凋亡過程中起重要作用。Fas 基因作為重要的凋亡調(diào)控基因，位于人類染色體10q，其編碼產(chǎn)物相對分子質(zhì)量約為45 000，是一種Ⅰ型跨膜受體蛋白，屬于腫瘤壞死因子/神經(jīng)生長因子(TNF/NGF)受體超家族，該蛋白是誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡的信號分子［9］，在正常細(xì)胞內(nèi)可通過信號傳導(dǎo)途徑逐級放大死亡信號，通過相應(yīng)受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)部，引起核內(nèi)轉(zhuǎn)錄基因的改變，從而啟動凋亡程序。FasL 基因位于染色體1q23［10］，主要分布于活化的T 細(xì)胞和NK 細(xì)胞，其編碼產(chǎn)物相對分子質(zhì)量為31 000，為Ⅱ型跨膜蛋白，屬于TNF 家族，可與其配體Fas 蛋白特異性結(jié)合，形成配體受體復(fù)合體，將細(xì)胞外的凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)部。Caspase 是天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶［11］，是由Caspase 基因家族轉(zhuǎn)錄表達(dá)的一類具有酶切作用的蛋白質(zhì)，目前已發(fā)現(xiàn)14 種［12］，其中Caspase-3 是主要的凋亡執(zhí)行蛋白，在被上游分子激活后能分解細(xì)胞骨架蛋白、細(xì)胞器等結(jié)構(gòu)，參與細(xì)胞凋亡的具體執(zhí)行過程［13］。Fas、FasL 和Caspase 家族在細(xì)胞凋亡過程中分別起著發(fā)出凋亡死亡信號、感知并轉(zhuǎn)導(dǎo)信號且逐級放大至細(xì)胞內(nèi)部、接受信號激活級聯(lián)反應(yīng)并產(chǎn)生效應(yīng)等一系列作用。此系統(tǒng)是細(xì)胞凋亡的最主要途徑之一，其中Caspase 蛋白的表達(dá)是各種細(xì)胞凋亡機(jī)制的最后共同通路，在細(xì)胞的信號傳遞過程中處于重要地位［14］。

該研究結(jié)果顯示，LiCl 對體外培養(yǎng)的U2-OS 細(xì)胞具有顯著的增殖抑制作用和凋亡誘導(dǎo)作用，且上述作用表現(xiàn)出劑量依賴性;細(xì)胞周期測定結(jié)果顯示，LiCl 可使U2-OS 細(xì)胞G1期細(xì)胞百分比下降，S 期細(xì)胞百分比則增高，且二倍體峰值隨藥物劑量增大呈下降趨勢，表明細(xì)胞被阻滯于S 期。以上結(jié)果初步證實LiCl 有抑制骨肉瘤細(xì)胞生長，促進(jìn)凋亡的作用。進(jìn)一步的檢測結(jié)果顯示，LiCl 作用后，U2-OS 細(xì)胞中Fas 和caspase-3 mRNA 的表達(dá)水平異常增高。因此，作者認(rèn)為，LiCl 可促進(jìn)U2-OS 細(xì)胞的凋亡，抑制其生長，上調(diào)促凋亡基因Fas 的表達(dá)，而Fas/FasL和Caspase 介導(dǎo)的死亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)則可能是其作用機(jī)制之一。

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