發(fā)動蛋白對心臟收縮-頻率反應的調控作用

葉江川，劉 班，李 俊，陳義漢

(1.同濟大學醫(yī)學院，上海 200092;2.同濟大學心律失常教育部重點實驗室，上海 200120)

發(fā)動蛋白(dynamin，DNM)是一類生物進化上高度保守的大鳥苷三磷酸酶(large GTPase)分子家族。DNM參與廣泛的細胞功能，包括網(wǎng)格蛋白介導的內吞、線粒體融合與分裂、順式高爾基網(wǎng)狀系統(tǒng)運輸、胞質分裂以及相關信號轉導過程［1］。DNM1主要定位于中樞神經(jīng)系統(tǒng);DNM2在體內廣泛表達;DNM3主要在睪丸表達，少量分布于神經(jīng)元。DNM有5個功能性結構域:GTP酶結構域、中間結構域、GTP酶效應結構域(GTPase-effector domain，GED域)、PH 結構域(pleckstrin homology domain，PH 域)以及富含脯氨酸的結構域(Prdine rich domain，PRD域)［2］。其中，GTP酶結構域是DNM 的酶活性結構域，對于GTP的結合及水解是必需的。最近的研究證明，果蠅的DNM同源基因Shibire突變后造成心臟二聯(lián)律的發(fā)生，提示DNM與心臟功能之間存在潛在聯(lián)系［3］。

心臟的收縮-頻率反應(force-frequency response，F(xiàn)FR)是心肌收縮的內在調節(jié)機制，即生理情況下，心臟收縮隨心率升高而增強。研究表明，正常FFR的受損或缺失是慢性心力衰竭的重要特征之一［4］。本研究擬采用重組腺病毒介導的基因導入技術，在成年大鼠心室肌細胞中對DNM2蛋白進行操縱，分析細胞對頻率變化的收縮反應，并觀察DNM2的藥物抑制對離體心臟FFR的影響，揭示DNM2在心臟FFR中的作用及其細胞學機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性 Sprague-Dawley大鼠，體質量250～300 g，上海西普爾必凱實驗動物公司提供。

1.2 主要試劑

Fura 2-AM購自美國 Molecular公司;選擇性CaMKⅡδ抑制劑KN-93、AIP及DNM 活性抑制劑Dynasore均購自美國Sigma公司;anti-PLB-pThr17抗體、anti-CaMKⅡδ抗體購自美國Santa Cruz公司，anti-DNM2抗體購自英國 Abcam公司，anti-PLB-pSer16抗體購自英國Badrilla公司，anti-CaMKⅡδ-pThr287購自美國 Millipore公司，anti-GAPDH抗體購自美國GST公司，化學發(fā)光試劑盒購自美國Pierce公司。

1.3 溶液配制

臺式液(mmol/L):NaCl 136.9，KCl 5.4，CaCl22，MgCl21，NaH2PO41，Hepes 10，Taurine 10，D-glucose 11.1，NaOH調節(jié)pH至7.35～7.45。RIPA(中)緩沖液(mmol/L):Tris 50，NaCl 150，Na2-EDTA 1，NaF 2，Na3VO40.2，1%Triton X-100，1%Sodium Deoxycho-late，1 × protease inhibitor cocktail，NaOH調節(jié)pH至7.4。Krebs-Henseleit(KH)緩沖液(mmol/L):NaCl 118，KCl 4.7，MgSO41.2，CaCl22.5，KH2PO41.2，NaHCO325，D-glucose 11，NaOH調節(jié)pH至7.4。

1.4 方 法

1.4.1 重組腺病毒的構建及擴增 突變型(K44A)DNM2的cDNA序列從ATCC網(wǎng)站獲得(DNM2K44A:MBA-95，http:∥www.atcc.org)。使用BP Clonase enzyme mix將上述序列分別克隆進pAd/CMV/V5-DEST載體，產生重組質粒 pAd/CMV/V5-DEST-DNM2K44A(pAd-DNM2-K44A)。重組質粒線性化并回收純化后，用Lipofectamine 2000TM將其轉染生長密度近90%的人胚胎腎細胞系293(HEK293)細胞。觀察細胞狀態(tài)，待病毒斑出現(xiàn)并且80%～90%的細胞崩解脫落時，收獲病毒液。將純化的病毒液在HEK293細胞中擴增，經(jīng)濃縮、滴度測定后，用定量PCR方法檢測目的基因表達情況。

1.4.2 成年大鼠心室肌細胞的分離培養(yǎng)及腺病毒轉染 采用經(jīng)典的酶解法分離成年大鼠心室肌細胞［5］并用199培養(yǎng)基進行無血清培養(yǎng)。在培養(yǎng)基中按照MOI=100加入攜帶突變型DNM2或GFP基因的重組腺病毒(Adv-DNM2K44A或Adv-GFP)配制成病毒培養(yǎng)基。Adv-GFP用作Mock陰性對照。將原有心肌細胞培養(yǎng)液棄去，加入最小體積的病毒培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。4 h后，將病毒培養(yǎng)基廢棄，加入正常體積的199培養(yǎng)基。用免疫印跡法檢測DNM2過表達情況以評估轉染效率。

1.4.3 心肌細胞收縮及鈣瞬變檢測 將轉染24 h的心肌細胞(部分實驗用 1 μmol/L KN-93或20 μmol/L AIP預處理細胞1 h)置于潔凈的灌流槽中，用32℃臺式液全程灌流。為誘發(fā)細胞收縮，用一對平行鉑電極對細胞施加頻率0.5 Hz、脈寬5 ms、強度15 V的場刺激。選取長桿狀、橫紋清楚且無自發(fā)收縮的細胞，用鈣-收縮檢測系統(tǒng)(Milton，美國)記錄肌節(jié)長度變化。為指示胞內Ca2+，用1 μmol/L鈣敏感染料Fura-2 AM 37℃避光負載細胞30 min，臺式液洗3遍并靜置20 min后，記錄細胞鈣瞬變;設置Fura-2 AM的激發(fā)波長為340 nm和380 nm，用對應的熒光強度之比表示細胞鈣水平。采集的信息通過IonWizard 6.0軟件記錄分析。

1.4.4 免疫印跡 用RIPA(中)緩沖液裂解轉染24 h后的心肌細胞，收集蛋白裂解產物。在裂解物中加入Laemmli上樣緩沖液，95℃變性5 min后在4%～20%的梯度膠上分離。將蛋白以濕轉方式轉印至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗，4℃孵育過夜。將膜取出并洗滌后，在常溫下與辣根過氧化物酶標記的二抗共同孵育1 h，用化學發(fā)光法顯影曝光。蛋白條帶的密度值用Quantity One軟件分析。

1.4.5 離體心臟FFR測量 大鼠麻醉后迅速取出心臟置于Langendorff裝置上，用37℃ KH緩沖液行主動脈逆行灌流。將連接壓力轉換器的乳膠球囊插入左心室以測量心室內壓，并在左心房和右心室各放置一枚刺激電極。在KH液中平衡15 min后，以0.5 Hz(300次/min)頻率起搏心臟。待心搏穩(wěn)定5 min后，在灌流液中加入Dynasore(20 μmol/L，溶于DMSO)并一直維持至實驗結束。為觀察離體心臟FFR，將刺激頻率提高為2 Hz(450次/min)，至少持續(xù)30 s。Powerlab數(shù)字化儀(AD公司，澳大利亞)觀察記錄左室壓力變化。用Lab Chart 7軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 重組腺病毒介導的DNM2活性抑制

蛋白印跡法顯示DNM2K44A在心肌細胞中得到了高效表達(圖1)。DNM2K44A由于GTP酶結構域上一個關鍵氨基酸的替換(K44A)，使其喪失了GTP 酶活性［6］，因此過表達 DNM2K44A能抑制DNM2活性。

圖1 腺病毒介導的DNM2K44A 過表達Fig.1 Adenovirus-mediated DNM2K44A overexpression n=3，與 Mock組比較，(1)P＜0.01

2.2 DNM2缺陷導致心肌細胞FFR損傷

Mock細胞在0.5 Hz起搏頻率下的肌節(jié)縮短分數(shù)(fractional shortening，F(xiàn)S)為(8.9±2.3)%(n=20 cells)，當頻率增加至2 Hz時，其FS變?yōu)?13.1±1.2)%(P＜0.05，正常 FFR);然而，DNM2K44A細胞的FS 在0.5 Hz下為(13.5±2.1)%(n=26 cells)，頻率升高為2 Hz時僅為(13.2±2.0)%，見圖2A和2C。DNM2K44A過表達雖然增強了基礎頻率下的細胞收縮(P＜0.05)，但卻降低了收縮儲備，導致FFR減弱或消失。

心肌細胞的收縮幅度主要受鈣瞬變的強度和持續(xù)時間影響［7］。在FFR中，F(xiàn)S的頻率依賴性變化伴隨著鈣瞬變大小的改變。Mock細胞在2 Hz下的鈣瞬變峰值較0.5 Hz增加了12.0%(n=20 cells，P＜0.05)，而 DNM2K44A僅增加了 1.5%(n=26 cells)，見圖2B和2D。提示DNM2失活引起的FFR損傷與鈣瞬變頻率依賴性的變化失調有關。

2.3 DNM2缺陷對PLB磷酸化與CaMKⅡδ活性的影響

為了考察DNM2失活引起的FFR損傷是否與PLB磷酸化相關，本研究分別檢測了在0.5 Hz和2 Hz起搏頻率下心肌細胞的PLB磷酸化水平。如圖3A和3C所示，Mock細胞在2 Hz下的 PLB Thr17位點磷酸化水平較0.5 Hz明顯增高(P＜0.05)，而DNM2K44A細胞則沒有這種差異。值得注意的是，DNM2K44A細胞在0.5 Hz下的 PLB Thr17位點磷酸化水平較Mock細胞升高(P＜0.05)。另外，PLB總蛋白及 Ser16位點磷酸化既無頻率依賴性的變化，亦無組間差異。

圖2 DNM2缺陷引起心肌細胞FFR損傷Fig.2 Impaired cardiomyocyte FFR induced by deficiency of DNM2

CaMKⅡδ對PLB的磷酸化修飾在心臟FFR的調節(jié)中起重要作用。本研究檢測了0.5 Hz和2 Hz起搏頻率下心肌細胞的CaMKⅡδ活性(Thr287位點磷酸化水平)，發(fā)現(xiàn)DNM2K44A過表達導致CaMKⅡδ Thr287位點磷酸化水平在0.5 Hz下較Mock細胞增高(P＜0.05)，但在2 Hz刺激時保持不變;而Mock細胞的CaMKⅡδ Thr287位點磷酸化發(fā)生了頻率依賴性的變化(P＜0.05，圖3B和3D)。

圖3 PLB與CaMKⅡδ的表達及磷酸化變化Fig.3 Expression and phosphorylation of PLB and CaMKⅡδ

2.4 CaMKⅡδ抑制劑對心肌細胞FFR的影響

選擇性CaMKⅡ抑制劑KN-93降低了DNM2K44A細胞0.5 Hz和2 Hz下的FS和鈣瞬變峰值(DNM2K44A:n=21 cells;DNM2K44A+KN-93:n=25 cells;DNM2K44A+AIP:n=23 cells;P＜0.05)，并使DNM2K44A細胞恢復了頻率依賴性的FS增長和鈣瞬變變化(P＜0.05)，提示FFR陽性(圖4)。另外，用AIP處理心肌細胞得到了類似的結果。這些結果說明，藥物抑制CaMKⅡδ活性能逆轉DNM2缺陷誘導的FFR損傷。

圖4 藥物抑制CaMKⅡδ活性對心肌細胞FFR的影響Fig.4 Effects of pharmacological inhibition of CaMKⅡδ activity on cardiomyocyte FFR

2.5 DNM2活性抑制對離體心臟FFR的影響

DNM2缺陷與心肌細胞FFR損傷有關，為了在器官層面上驗證DNM2對FFR的作用，本研究采用含Dynasore(DNM的GTP酶活性抑制劑)的KH液對離體心臟進行灌流并觀察其FFR。結果顯示，對照組心臟(用DMSO處理)在450次/min起搏頻率下的收縮力(dP/dtmax)較300次/min增加了(53±3.3)%(n=13)，而Dynasore處理組僅增加了(12±2.8)%(n=15)，見圖 5。因此，Dynasore介導的DNM2抑制削弱了離體心臟FFR。

圖5 DNM2活性抑制對離體心臟FFR的影響Fig.5 Effects of DNM2 inhibition on ex vivo FFR

3 討 論

心輸出量由每搏輸出量和心率決定。當心率加快(如運動時)，心臟收縮必須隨之加強，以彌補舒張期充盈減少，保證足夠的心輸出量。頻率升高引起L型鈣通道(L-type calcium channel，LTCC)依賴的Ca2+內流增多，同時舒張期的縮短使Ca2+排出減少，最終導致胞漿和肌質網(wǎng)Ca2+水平增高、肌節(jié)收縮加強，這是正常陽性FFR的主要細胞學機制［4］。研究表明，PLB依賴于CaMKⅡδ活性的Thr17位點磷酸化隨頻率升高而增強［8］，上調的PLB磷酸化促進肌質網(wǎng)Ca2+釋放和肌節(jié)收縮。PLB頻率依賴性的磷酸化改變是心臟FFR的內源性機制之一。本研究發(fā)現(xiàn)，DNM2對于心臟FFR是必需的，DNM2失活引起的FFR損傷與CaMKⅡδ活性上調和PLB磷酸化增強有關。

DNM2是細胞內囊泡轉運的多能性調節(jié)分子。DNM2的正?；钚钥烧{控LTCC從細胞膜向胞漿的運輸［9］，DNM2 功能缺失(DNM2K44A過表達)將引起LTCC 在細胞膜的滯留。Muth 等［10］和 Chen 等［11］報道，LTCC α1c或β2a亞基膜表達上調可引起微小的持續(xù)性Ca2+內流，導致胞漿和肌質網(wǎng)鈣超載。在基礎頻率下，DNM2K44A細胞膜LTCC的分布增多促進了Ca2+進入胞漿，提高了胞漿和肌質網(wǎng)鈣含量;肌質網(wǎng)高鈣負荷使鈣瞬變增加，細胞收縮增強，F(xiàn)S升高。由于胞漿和肌質網(wǎng)Ca2+水平在基礎頻率時已經(jīng)顯著升高，DNM2K44A細胞的頻率依賴的鈣上調機制作用減弱，導致高頻刺激下鈣瞬變和肌節(jié)收縮無法進一步增強，形成FFR損傷。不僅如此，在Mock細胞中，頻率依賴的、CaMKⅡδ活性介導的 PLB Thr17位點磷酸化增強促進了SERCA2a開放，使舒張期Ca2+回吸收增加，肌質網(wǎng)Ca2+水平升高，鈣瞬變和肌節(jié)收縮增強(正常FFR);DNM2功能抑制使得PLB Thr17位點的磷酸化在基礎頻率下已達“飽和”狀態(tài)，頻率升高并不能使其進一步增強(圖3A和3C)，因而促成了FFR損傷。

CaMKⅡδ活性在DNM2K44A細胞中是上調的(圖3B和3D)，藥物抑制CaMKⅡδ可驗證CaMKⅡδ活性在DNM2缺陷誘導的FFR損傷中的作用。應用KN-93可逆轉DNM2失活引起的FFR損傷(圖4)。由于KN-93存在一些非特異性藥理作用(如抑制鉀通道等)，用特異性更強的 AIP處理DNM2K44A細胞，得到了與KN-93類似的結果(圖4)。在DNM2K44A細胞中，藥物介導的CaMKⅡδ抑制降低了PLB Thr17位點在基礎頻率下的磷酸化，引起SERCA2a活性下調、肌質網(wǎng)鈣含量減少，肌節(jié)收縮減弱;當頻率升高時，胞漿和肌質網(wǎng)Ca2+水平升高導致的促收縮效應超過了CaMKⅡδ抑制的影響，DNM2缺陷誘導的FFR損傷得到恢復，盡管高頻刺激下的肌節(jié)收縮和鈣瞬變仍較無藥物處理組弱。Kushnir等［12］報道，抑制 CaMKⅡ可完全阻斷心臟正常FFR，提示CaMKⅡδ的正常活性是心臟FFR所必需的，過高或過低都會引起FFR失調。

DNM2缺陷不僅引起了心肌細胞FFR損傷，也能誘導離體心臟FFR障礙。Dynasore是一種細胞穿透性的DNM抑制劑，能選擇性地抑制DNM2的GTP酶活性［13］。Dynasore介導的DNM2失活造成心臟對高頻起搏的反應性下降，提示DNM2對離體心臟FFR具有調控作用。

綜上所述，DNM2在維持心臟正常收縮-頻率反應中起重要作用。DNM2功能缺失能干擾細胞鈣水平并增強PLB依賴于CaMKⅡδ的磷酸化，進而削弱FFR。DNM2作為調控心臟FFR的重要分子，可能成為心力衰竭等心臟疾病的藥物干預靶點。

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