HPLC測(cè)定腎康口服液中大黃酸、大黃素和大黃酚的含量

秦靜海，曹站霞

(河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南鄭州 450000)

腎康口服液為我院院內(nèi)制劑，由大黃、白花蛇舌草、牡蠣、川芎等組成，具有蕩滌濁毒、清熱活瘀的功效。大黃［1］為其君藥，主要活性成分為大黃酸、大黃素、大黃酚等。目前對(duì)腎康口服液的質(zhì)量控制主要依據(jù)薄層色譜法來(lái)進(jìn)行定性監(jiān)測(cè)，可該法不能很好地反映其內(nèi)在真實(shí)質(zhì)量。HPLC能對(duì)藥品的主要有效成分進(jìn)行定量監(jiān)測(cè)，是當(dāng)前的藥品質(zhì)量控制的通用方法。本文擬建立腎康口服液的HPLC方法，為進(jìn)一步提高腎康口服液質(zhì)量的穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)確保臨床療效奠定基礎(chǔ)。

1 藥品、試劑與儀器

腎康口服液，10 mL/支，制劑號(hào)為豫藥制字Z04010431，批號(hào) 111026，111210，120217;實(shí)驗(yàn)藥材均取自河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部陳天朝主任藥師鑒定為正品。大黃酸(批號(hào)0757-200206)、大黃素(批號(hào)110756-200110)、大黃酚對(duì)照品(批號(hào)110796-200716)，均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供;甲醇為色譜純，其余試劑為分析純。Waters 2695高效液相色譜儀，美國(guó)沃特世公司產(chǎn)品;色譜柱為Agilent C18(4．6 mm ×150 mm，0．5 μm)，安捷倫科技有限公司產(chǎn)品;Sartorius CP225D電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件

采用 Agilent C18(4．6 mm ×150 mm，5μm)色譜柱，以甲醇-0．1%磷酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫(見表1)，體積流量1．0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，進(jìn)樣量20 μL。理論板數(shù)按峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

表1 梯度洗脫程序

2．2 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取大黃酸、大黃素、大黃酚對(duì)照品1．05，0．15，0．13 mg 置于 25 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻即分別得到42．016 mg/L的大黃酸溶液、5．968 mg/L 大黃素溶液和5．200 mg/L大黃酚溶液。

2．3 供試品溶液的制備

精密量取(取前搖勻)各樣品2．0 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。用0．45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2．4 陰性對(duì)照液的制備及干擾試驗(yàn)

按處方取去除大黃的藥材，按樣品工藝同法制備，制得陰性對(duì)照樣品，再按供試品溶液的制備方法操作，制成陰性對(duì)照溶液。將對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各進(jìn)樣20 μL，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果見圖1。結(jié)果表明：供試品色譜中，與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，具有相同保留時(shí)間的色譜峰，而陰性對(duì)照色譜中無(wú)干擾。

圖1 腎康口服液對(duì)照品及供試品色譜圖

2．5 線性關(guān)系考察

精密吸取大黃酸、大黃素和大黃酚對(duì)照品的混合液 0．5，1．0，2．0，3．0，4．0，5．0 mL，分別置于5 mL容量瓶中;加甲醇稀釋至刻度;再精密吸取上述對(duì)照品溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀中。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X，峰面積為縱坐標(biāo)Y建立三者的標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果：大黃酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=3 ×106X-5 019．9，r=0．999 8(n=6);大黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 Y=3 ×106X+1 436．9，r=0．999 8(n=6);大黃酚標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=5×106X+2 260．8，r=0．999 8(n=6)。表明：大黃酸、大黃素、大黃酚濃度分別在 4．201 6 ～42．016 0 mg/L、0．596 8 ～5．968 0 mg/L、0．52 ～5．20 mg/L 范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2．6 精密度試驗(yàn)

取大黃酸、大黃素、大黃酚混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，大黃酸、大黃素、大黃酚RSD 值分別為0．44%，1．31%，1．35%。結(jié)果表明：精密度良好。

2．7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，按供試品溶液制備方法平行處理6份，依法測(cè)定，大黃酸、大黃素、大黃酚峰面積 RSD 值分別為 0．30%，2．26%，2．12%。結(jié)果表明：重復(fù)性良好。

2．8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液，分別于制備后0，2，4，8，12，48 h 各進(jìn)樣 1 次，大黃酸、大黃素、大黃酚RSD 值分別為1．21%，2．43%，2．59%。結(jié)果表明：供試品溶液中大黃酸、大黃素、大黃酚含量在48 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2．9 加樣回收率試驗(yàn)

取已知大黃酸、大黃素、大黃酚含量的樣品溶液6份，分別精密加入對(duì)照品溶液適量，按供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，按樣品測(cè)定方法測(cè)大黃酸、大黃素、大黃酚含量。結(jié)果：大黃酸平均回收率為102．59%，RSD值為1．06%;大黃素平均回收率為99．90%，RSD值為2．85%;大黃酚平均回收率為100．41%，RSD 值為1．89%。見表2～4。

表3 大黃素加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表4 大黃酚加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2．10 樣品含量測(cè)定

按上述方法，制備供試品溶液，測(cè)定3批腎康口服液中大黃酸、大黃素、大黃酚的含量，結(jié)果見表5。

表5 3批樣品中大黃酸、大黃素和大黃酚含量測(cè)定結(jié)果 mg·L-1

3 討論

本實(shí)驗(yàn)最初采用2010版《中藥藥典》一部大黃項(xiàng)下甲醇-磷酸水溶液等度洗脫的方法，但色譜峰有重疊、拖尾的現(xiàn)象，不能得到良好的分離效果。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)，采用梯度洗脫的方法，達(dá)到了良好的分離。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)腎康口服液HPLC的方法學(xué)考察得出：本試驗(yàn)條件用于腎康口服液中大黃酸、大黃素、大黃酚的含量測(cè)定，方法穩(wěn)定、可靠，可作為控制本品質(zhì)量的有效方法。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典：一部［M］．北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：22．

［2］高學(xué)敏．中藥學(xué)［M］．北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2007：158．