腫瘤血管生成的影像學評價及新進展

劉 麗綜述，許 健，盧光明審校

0 引 言

血管生成是實體腫瘤發(fā)展、浸潤及轉移的關鍵步驟，受多種因素調節(jié)及腫瘤微環(huán)境和遺傳因素影響。當實體瘤體積超過1～2 mm3時，其生長和轉移均需通過血管形成獲得氧和營養(yǎng)［1-3］?？寡苌芍委煬F已成為腫瘤靶向治療的重要研究領域，在臨床試驗中顯示出很好的療效，列入腫瘤的標準治療方案，有可能取得突破性進展。但目前在臨床實際應用中抗血管生成治療的效果尚不夠滿意［5-7］。血管生成是基本的生理學或病理學變化，對血管生成狀態(tài)的有效評估能夠反映組織微環(huán)境狀況及生物學形態(tài)，評價腫瘤組織對治療的反應。評價血管生成狀態(tài)的“金標準”是微血管密度(microvessel density，MVD)，但因其有創(chuàng)性、對準確取材的依賴性、離體性、非功能性評價等缺點而未能成為理想的評價血管生成手段。采用各種腫瘤標志物和新的成像技術對腫瘤的新生血管進行可視化及定量研究有助于了解腫瘤的生物學行為，并可在進行腫瘤抗血管治療時無創(chuàng)地全程監(jiān)測腫瘤血管生成的狀態(tài)，從而進行腫瘤治療的療效評價。多種影像技術包括光學成像、超聲成像(ultrasound，US)、CT、MRI、正電子發(fā)射型計算機斷層顯像(positron emission computed tomography，PET)、單光子發(fā)射計算機斷層成像術(single-photon emission computed tomography，SPECT)、分子影像及多模式成像等均可用于血管生成狀態(tài)的評價。本文介紹不同影像技術在腫瘤抗血管生成治療療效評價方面的研究現狀及新進展［8-15］。

1 顯微光學成像技術

光學成像是通過探測活體細胞、組織及動物中示蹤劑發(fā)出的可見光顯示靶區(qū)域內示蹤劑的分布來反映感興趣區(qū)的結構及功能信息。其已發(fā)展成為可視化及定量的成像模式，可在活體觀察腫瘤的血管結構、滲透性及BF。光學成像可分為生物體發(fā)光成像(bioluminescence imaging，BLI)和熒光成像(fluorescence imaging，FLI)2個主要成像模式，都可應用于血管生成成像［16］。BLI是將熒光素酶標記的目標細胞導入到小動物體內，通過與注入的熒光素發(fā)生酶促反應，產生可探測的光子而形成的二維圖像，具有相對高的靈敏度。相比而言，FLI是通過特定波長的外部光源激發(fā)內源性蛋白如膠原蛋白、血紅蛋白，或注入的外源性熒光化合物如綠色熒光蛋白以及其他光學對比劑，發(fā)射不同級別低能量光子，經探測過濾后的光譜成像。雖然BLI主要用于腫瘤成像，但有研究表明以血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)或血管內皮生長因子受體2(VEGFR2)作為報道分子的轉基因動物模型可以用于腫瘤血管成像研究。但是目前用于腫瘤血管生成成像的主要是FLT，可分為活體顯微成像技術(in vivo intravital microscopy，IVM)、近紅外線熒光成像技術(near-infrared fluorescence，NIFR)和綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)成像技術等。結合多種高分辨顯微光學成像技術，例如共聚焦激光掃描顯微鏡、多光子激光掃描顯微鏡、原位掃描量子顯微鏡、表面熒光顯微鏡等，達到顯微結構成像的效果［17］。再應用某些內皮特異表達的轉基因動物模型如Tie2-GFP及eNOS-GFP小鼠等實現在體血管成像［18］。此外，新的光學成像技術正在應用于血管生成的成像。如可用于觀測血管結構及血流速的光學相干層析成像(optical coherence tomography，OCT)、能對體表直徑2 mm以下的毛細血管進行動態(tài)灌注3-D成像的光學微血管造影術(optical microangiography，OMAG)、可獲得三維血管造影數據光頻域成像(optical frequency domain imaging，OFDI)等［19］。

綜上所述，許多微血管顯微光學成像像技術在臨床前的血管生成成像研究中顯示出優(yōu)勢，具有一定的臨床應用前景。光學成像最主要的局限性是光的穿透性較差和體內屏蔽效應，使該技術不可能達到體內深部成像的效果。但由于光學成像具有靈敏度高、成本低、技術簡單的優(yōu)勢，是小動物實驗研究的良好方法。

2 US

US因具有實時掃描成像、無電離輻射及價格低廉的特點，成為理想的評價腫瘤血管生成狀況的模式。臨床上用于血管生成成像的方法主要有彩色多普勒成像及超聲造影成像等方式。彩色多普勒成像可以方便地測量血管的變化，諸如血管直徑、血流速度、阻抗系數、血液容積等參數。但是在成像過程中受到血流方向、聲束和探測角度的影響，對于血管結構復雜及血流方向混雜的部位的成像常難以真實反應血管生成狀態(tài)，且受超聲本身特性及發(fā)射頻率的影響而限于探測表淺部位的血管變化，如乳腺、子宮、前列腺、甲狀腺等。近年來，伴隨著各種超聲增強檢查方法快速發(fā)展，超聲造影檢查廣泛應用于臨床前腫瘤血管生成成像模型及臨床腫瘤血管生成狀況評價。如脈沖反轉諧波成像(pulse inversion harmonic imaging，PIHI)、能量多普勒成像(power doppler imaging，PDI)及動態(tài)增強超聲成像(dynamic contrast material-enhanced ultrasonography，DCE-US)等，結合圖像后處理技術如最大密度投影(maximum intensity projection，MIP)，采用各自不同的參數、得到腫瘤組織時間-強度曲線可視化的、定量的描述血管結構及與MDV存在的關系來反映腫瘤血管生成及抗血管生成治療效應［20］。其中DCE-US提供了一種定量、可靠、敏感、實時檢測腫瘤血管灌注及評估抗血管治療效應的方法［21］。通常以膠囊微泡的形式靜脈注射，微泡直徑在1～10 μm之間，多采用脂質、蛋白和多聚體。對比劑有2種靜脈注射方法，其一是團注式注入法，檢測單平面內動態(tài)增強效果，其成像參數有曲線下面積(area under concentrationtime curve，AUC)、造影劑平均通過時間(mean transit time，MTT)、達峰值時間(time to peak，TTP)、最大增強值(peak enhancement，PK)。另一種是連續(xù)注入法，在高強度的超聲脈沖沖擊下，小區(qū)域內所有微泡破壞崩解，然后應用周期成像技術的低振幅超聲序列來測量此區(qū)域在重新充滿微泡的同時微血管內的血流速度。其成像參數有血容量(blood volume，BV)、平均血流速度(mean flow velocity，VM)。有研究表明在腎癌抗血管治療后的評價中，這2種成像參數與MVD存在一定相關性，可用來評價腫瘤抗血管生成治療后的療效，但其對于患者預后的評價有待進一步研究［22-23］。近來超聲靶向對比劑如整聯(lián)蛋白靶向、生長因子靶向、活性內皮細胞靶向及雙靶向微泡等迅速發(fā)展，使US進入分子影像階段。因此US是簡便有效的血管生成成像方式，結合分子影像的技術，開發(fā)新的對比劑，應用新的成像技術，US在檢測腫瘤血管生成方面將具有廣闊的前景。

3 CT灌注成像技術(computed tomography perfusion imaging，CTPI)

CT灌注成像是一種功能成像，利用正常組織及腫瘤組織在對比劑動態(tài)增強上的差異，通過對感興趣層面進行動態(tài)掃描，獲得該層面的時間-密度曲線(time density curve，TDC)，得出血流量(blood flow，BF)、BV、血流 MTT、TTP、最大強化指數(peak enhancement index，PEI)及表面滲透系數(permeability surface，PS)等定量參數，采用量化的方式反映局部血流灌注量的改變和組織血管化程度。是一種無創(chuàng)性檢查技術，可以從毛細血管水平評估組織灌注。有研究表明，在肺癌、結腸癌、胰腺癌、乳腺癌、胃腺癌、腎癌及腦膠質瘤等惡性腫瘤中，MVD及VEGF的表達水平與良性腫瘤中的表達存在顯著差異，且與CTPI參數中的BF、BV、PS及MTT值也存在一定相關性［24-27］。Ma等［25］對60 例良性和惡性肺腫瘤的患者進行CT灌注成像顯示VEGF陽性的患者，MVD與周圍型肺癌的BF、BV、PS存在明顯的正相關性，從而證實CTPI可以作為鑒別腫瘤良、惡性的方法。Jiang等［28］對16只兔肝癌模型進行CT灌注成像發(fā)現BF、PS與MVD及VEGF存在明顯正相關，但是未發(fā)現MTT及BV與MVD及VEGF存在相關性。另外Park等［29］對30例以吉西他賓為基礎化療藥物的胰腺癌患者行CT灌注掃描，從ROC曲線判斷治療有效和無效的最佳灌注參數值。說明DCE-CT參數可以反映腫瘤的惡性程度和腫瘤血管增生程度，對于術前判斷腫瘤級別、確定手術切除范圍、放療范圍化療方案選擇都具有重要臨床意義［10］?？傊珻T灌注成像是一種直觀、準確、在體和無創(chuàng)性的影像學檢查手段，能較客觀、量化地反映腫瘤組織內血管生成及血流動力學改變，有效地評價腫瘤生長及患者預后狀況，可為診斷和治療方案的選擇提供有力依據［28］。

4 MR成像技術

MR成像技術作為無創(chuàng)的在體腫瘤結構及功能成像方式，具有較高的軟組織分辨率及多序列、多參數、多方位成像的優(yōu)點，已經廣泛應用于臨床及臨床前研究中。目前，主要評價腫瘤血管生成的方法有動態(tài)磁共振對比劑增強成像(dynamic contrast-enhanced MRI，DCE-MRI)、穩(wěn)態(tài)磁共振對比劑增強成像(steady-state contrast-enhanced MRI，SSCE-MRI)及非對比增強類成像如擴散加權成像(diffusion weighted imaging，DWI)、血氧水平依賴的(blood oxygenation level dependent，BOLD)功能成像、動脈自旋標記(arterial spin labeling，ASL)。

4.1 磁共振對比增強成像

4.1.1 DCE-MRIDCE-MRI是通過連續(xù)采集對比劑注入后的三期圖像，綜合分析對比劑進入和排出腫瘤的動力學過程，建立藥代動力學模型，描述腫瘤內血管密度和屬性。目前此種方法初步用于評價各種腫瘤治療前后瘤內微血管結構和功能變化。Hillman等［30］采用KCI-18人腎細胞癌模型研究DCEMRI在化療方案選擇中的應用，研究發(fā)現每天給予舒尼替尼20 mg/kg可使腫瘤血管正?；鴮е履[瘤灌注增加，證明DCE-MRI能夠為給藥方案的選取提供幫助。DCE-MRI多采用梯度回波或者飽和恢復/反轉快速梯度回波(T1WI)序列或者回波平面成像(echo planar imaging，EPI)序列，對比劑的順磁性作用縮短T1時間達到可視化的組織強化效果，同時采集到的DCE-MRI數據繪成腫瘤血流流入及流出曲線，采用廣泛使用的Tofts血流雙室動力學模型所提出的標準化動態(tài)測量方法，獲得定量參數有:容積轉移常數(transfer constant，Ktrans)，滲漏空間(fractional extracellular space，Ve)，速度常數(rate constant，Kep)以及部分血漿容積(fractional tumor plasma volume，fpv)。半定量參數包括強化出現時間(T1 onset time)、TTP、最大信號強度及強度曲線下初始面積(initial area under the tracer concentrationtime curve，iAUC)。有研究表明在經抗血管治療后腫瘤組織Ktrans、Ve及Kep下降，且Ktrans最能反映腫瘤血管的灌注及滲透特性［31］。Schnell等［31］采用磷酸酰肌醇三激酶(phosphatidylinositol 3-kinases，PI3K)的抑制劑NVP-BEZ235來抑制BN472荷瘤小鼠模型的腫瘤血管。采用DCE-MRI掃描后，發(fā)現小鼠腫瘤的Ktrans值較對照組明顯下降。臨床研究中，Wedam等［32］報道局部乳腺浸潤性癌患者在使用貝伐單抗(bevacizumab)治療1個療程后，患者腫瘤組織Ktrans值，kep和Ve下降?，F在臨床中主要運用小分子對比劑(Gd-DTPA)成像，但是由于小分子對比劑在體內消除過快，體內分布無特異性，導致多數MRI增強圖像對比不夠鮮明，造成腫瘤定性的困難。而能夠長時間停留于血管內的大分子對比劑(macromlecular contrast agents，MMCA)、血池對比劑、順磁性納米粒子(paramagnetic nanoparticle，PN)尚處于實驗階段，此外超順磁性氧化鐵類對比劑是MRI對比劑研究的一個重要的新興領域［33］。MRI靶向對比劑的研究現在主要集中于釓類和納米鐵類復合物，其能夠特異性聚集于血管生成因子濃度高的部位，顯示腫瘤血管生成狀況。Wu等［34］通過使用大分子對比劑(GDCC-40)的DCE-MRI來監(jiān)測貝伐單抗治療HT-29小鼠皮下異種移植瘤的療效，治療后發(fā)現Ktrans值和fpv值明顯降低，與病理組織學結果一致。因此，DCE-MRI可以及時有效的評價抗腫瘤血管生成治療的療效［9-10，35-36］。

4.1.2 SSCE-MRI SSCE-MRI是使用 T2 對比劑(超順磁性二氧化鐵顆粒，大小約45～60 nm)，采集快速回波序列及中快速小角度成像序列(fast lowangle shot sequence，FLASH)增強前后的圖像數據，根據一定換算關系得到相關參數:血管密度指數(relative vessel density index，rVDI)和血管大小指數(relative vessel size index，rVSI)，反應微血管結構信息。有研究表明Ktrans與血管密度存在一定的關系，但是由于腫瘤微環(huán)境的復雜性，其與rVDI和rVSI之間的精確關系還有待進一步研究。rVDI也與MVD存在一定相關性。在今后的研究中或許可以用rVDI來替代MVD成為無創(chuàng)性的評價腫瘤血管生成的標準［37］。

DCE-MRI及SSCE-MRI能夠提供腫瘤血流灌注、滲透性及血管密度、大小等信息，且能在體、重復的應用于腫瘤血管成像的過程中，評價腫瘤抗血管生成治療各階段的療效狀況。

4.2 磁共振非對比增強成像

4.2.1 彌散加權成像(diffusion weighted imaging，

DWI)DWI是通過探測組織內水分子擴散運動狀況形成磁共振信號反映組織結構功能狀態(tài)，運用表觀擴散系數(ADC值)定量評估分子運動，其主要影響因素包括腫瘤細胞密度、腫瘤組織基質成分、組織灌注狀態(tài)及細胞膜通透性等。雖尚未發(fā)現DWI與血管生成之間的直接關系，但是有研究認為高ADC值的腫瘤表現出對抗血管生成治療敏感性的增高［38］。Jansen 等［35］報道稱 DWI可用于預測及評價腫瘤抗血管治療的反應。Koh等［38］對15例實體腫瘤(主要是結直腸癌及卵巢癌)患者研究表明病灶壞死邊緣區(qū)域血管ADC值較高，對貝伐單抗具有顯著反應。Liu等［39］對38例前列腺癌患者的ADC與血管生成之間關系的研究表明ADC與MVD及VEGF間存在負相關關系，有待進一步證實。Galban等［40］研究表明治療后ADC值的增加預示著良好預后，故認為DWI對抗血管生成治療預后評估的應用中具有良好前景。

4.2.2 血氧水平依賴效應(blood oxygenation level dependent，BOLD)功能成像法 血紅蛋白氧合狀態(tài)不同，對磁場的反應也不同。氧合血紅蛋白為反磁性物質，不引起質子失相位;而去氧血紅蛋白為順磁性物質，破壞局部磁場均勻性，縮短T2、T2*時間，使局部信號顯著減低。梯度回波和多平面回波序列對T2*效應敏感，常用于BOLD成像。使用高氧、高二氧化碳混合氣體(95%氧氣，5%二氧化碳)，一方面高濃度氧氣使血氧飽和度提高，另一方面高碳酸血癥使血管擴張，BF增加，兩種方法均有增加血管內氧合血紅蛋白量的作用，使BOLD成像信號進一步提高。惡性腫瘤生長旺盛，氧耗量增加，乏氧與腫瘤血管生成構成相互促進又相互制約的矛盾平衡體，而BOLD成像的信號強度既受血液氧合度、組織氧耗量的影響，又受局部血液BF、血流速度、血管通透性等影響。所以BOLD成像可了解組織BV、BF及血氧含量的變化，從而間接反映腫瘤血管生成的狀態(tài)。腫瘤血管多為不成熟血管，管壁缺乏血管周細胞及平滑肌細胞，對氧的縮血管效應和二氧化碳的擴張血管效應均不敏感，所以BOLD成像有助于評估腫瘤血管成熟度，即腫瘤血管正?；F象。有研究認為對腫瘤的抗血管生成治療只是針對腫瘤中未成熟的血管，而對成熟血管功能并無影響。所以利用BOLD評價腫瘤血管成熟度，可以用影像學方法為腫瘤抗血管治療找到血管正?；闹委煛皶r間窗”。雖然BOLD成像對腫瘤血供狀態(tài)、血管性能及細胞功能等改變較敏感，且不用使用造影劑，但受多種因素的影響，圖像對比度差，其在臨床應用也有待進一步研究［41］。

4.2.3 動脈自旋標記(arterial spin labeling，ASL)法ASL是利用動脈血液中的質子作為內源性對比劑，通過檢測受標記的質子在流經感興趣區(qū)時組織信號強度的變化反映局部血流信息。采用特殊的脈沖序列標記流入興趣區(qū)前的動脈血液，標記的血液質子在興趣區(qū)內流動的過程中不斷與周圍水分子發(fā)生交換，血液宏觀磁化矢量發(fā)生改變。通過標記前后的組織圖像剪影及數據轉換即可得到興趣區(qū)的局部BF及BF等灌注信息反應血管生成狀態(tài)［42］。因需對流入興趣區(qū)的動脈血流進行射頻標記，ASL技術通常適用于研究供應血管血流方向單一的器官。應用流速編碼技術有助于避免血流速度發(fā)生病理或者生理性改變時出現的計算偏差。所以，除應用于中樞神經系統(tǒng)外，還可用于卵巢、腎臟等器官的研究，評估卵巢血供的生理性周期和腎細胞癌治療后的改變，未見報道用于肝等血供復雜的器官。de Bazelaire等［42］利用ASL技術評價10例抗血管生成治療后的腎癌轉移患者的腫瘤灌注發(fā)現，抗血管生成治療有效的患者早在接受治療1個月后即出現腫瘤區(qū)域BF的顯著降低，而無效者在治療1個月后腫瘤BF無降低甚或僅有輕度增加，說明ASL-MRI可用于腫瘤抗血管治療效果的評估及預測。

5 核醫(yī)學成像

PET及SPECT是核醫(yī)學成像的2個主要的成像方式，均可以從分子及功能水平對腫瘤血管進行非侵襲性成像。其顯示腫瘤血管生成的方法有，2類，其一是采用放射性示蹤劑法測量由腫瘤血管新生引起的生理和功能變化，定量觀察與血管生成有關的參數，包括BF、BV、氧攝取量、毛細血管通透性和糖代謝。Groves等［43］的研究表明，在早期的乳腺癌中，FDG-PET檢查證明18F-FDG的攝取與腫瘤血管生成存在顯著相關性，而且腫瘤新生血管是早期乳腺癌的獨立、明顯的征兆。其二是顯示血管生成的基因表達，以明確血管生成的特定分子機制及基因表達。近來有研究表明其在血管生成成像中的有關分子標記示蹤劑的迅速發(fā)展，顯著提高成像效果。在 PET 成像中，整合素 avβ3(integrinavβ3)，VEGF/VEGFR，基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)作為分子標志可提高腫瘤血管成像的敏感性及特異性［12］。在SPECT中，標志分子整合素avβ3、VEGF和細胞-細胞外基質(cell-extracellular matrix，ECM)的示蹤劑使SPECT對腫瘤血管生成及抗血管生成治療后的評價具有良好的前景［11，44］。

6 分子影像學成像

分子影像是指利用諸如光學成像、US、CT、MRI、PET、SPECT等成像技術結合分子標志物對生物體或者細胞的生理病理學進程的可視化、定量展現的方法?？蓮募毎?、分子、蛋白及基因水平研究腫瘤的生物學特性進行腫瘤治療療效評價。分子成像的關鍵因素之一是靶分子的選擇，根據腫瘤血管形成的機制和腫瘤血管結構，可以內皮細胞、血管生成相關基因、血管干細胞及促血管生成因子及受體作為靶向標記形成靶向分子探針，結合相應的成像工具對腫瘤血管的結構及功能進行活體內顯像，探索腫瘤血管生成的機制，監(jiān)測腫瘤血管生成的狀態(tài)。成功的分子影像除了要有特異性的分子靶點之外，還需要有理想的分子探針及高敏感性成像技術。因此，進一步在分子層面提高血管生成成像水平則需要探索新的血管生成靶點及相應特異配體進而優(yōu)化現有的成像的分子探針。目前多數靶向血管新生分子探針只是適合光學及核素成像，在與核素成像結合中，PTE/CT及PET/MRI的出現代表分子影像最前沿的檢查技術，結合多靶向的分子探針形成多模態(tài)影像成像方式可獲得結構、功能及代謝等方面的全方位信息。其在臨床的應用必將對分子影像學的發(fā)展產生深遠影響，也將提高腫瘤血管生成靶向成像及療效評價水平［45］。

7 多模式成像方式

綜上所述，單一的成像方式對于腫瘤血管成像不夠全面，各種成像方式在評價腫瘤血管生成成像中均存在弊端［46-47］。如光學成像敏感性較高，但組織穿透力弱;MR成像空間分辨率高，檢測深度不受限制，但成像敏感性較差;PET和SPECT成像雖然成像敏感度高，但空間分辨率差等。因此需要探求定向的血管生成及多模式生物標記，目前已知VEGF受體及αvβ3整聯(lián)蛋白為血管生成的重要靶點，偶聯(lián)多種放射標記的配體應用于多種成像系統(tǒng)中將彌補單一成像的不足，如用于 SPECT中的99Tc-NC100692及用于MR成像的RGD-SPIO納米粒都是多模式的靶向血管成像探針?？傊?，融合2種或2種以上成像方式，尋求多模式的、多技術的、成像方式從結構、功能和分子水平來更好的評價治療前后腫瘤血管的狀況將是腫瘤血管生成成像的發(fā)展的重要趨勢［15］。

8 結 語

因為抗血管生成治療具有靶向性高、不良反應少、耐藥性低的特點，現已逐漸從實驗室走向臨床。隨著對血管生成理論及抗血管生成治療方案研究的不斷深入，腫瘤血管生成機制及其在腫瘤進展、轉移中的作用進一步明確。但是抗血管生成治療還存在以下有待解決的問題:①腫瘤血管生成機制的進一步明確;②新的抗腫瘤血管生成藥的研發(fā);③新的抗血管生成治療方案的探索;④合理、有效的療效評價系統(tǒng)的確定。多方位、多功能、多參數的各種腫瘤血管成像技術也在不斷應用于臨床，提供以下信息，進一步優(yōu)化腫瘤抗血管治療方案:①早期診斷腫瘤以及預知腫瘤治療狀況;②提供不同的腫瘤血管生長狀態(tài)以選擇抗血管治療方案;③最適合的給藥劑量;④監(jiān)測腫瘤狀態(tài)及抗血管治療后的療效。腫瘤抗血管生成治療作為高速發(fā)展的腫瘤分子靶向治療的將在多學科、新技術的推動下取得新的突破，使腫瘤治療取得突破性的進展。

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