TNF-α介導(dǎo)的NF-κB信號通路在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎血管形成中的作用

石 慧，王丹彤，烏日嘎(綜述)，李鴻斌(審校)

(1．內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院(包鋼醫(yī)院)，內(nèi)蒙包頭014010;2．內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，呼和浩特010010)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種不明原因的多系統(tǒng)性自身免疫性疾病，以關(guān)節(jié)滑膜炎、血管翳及對稱性、破壞性的關(guān)節(jié)病變?yōu)橹饕卣?。RA的病理過程有多種免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子及細(xì)胞信號通路參與。腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factoralpha，TNF-α)是 RA 病程中最早產(chǎn)生的細(xì)胞因子之一，可與其他細(xì)胞因子一起促進RA滑膜血管新生。核因子κB(nu-clear factor-κB，NF-κB)是真核細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的核轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞凋亡、病毒復(fù)制、腫瘤發(fā)生、炎癥及各種免疫疾病等的基因表達中發(fā)揮了重要的作用。TNF-α刺激NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活在RA炎性反應(yīng)、血管形成中發(fā)揮重要作用，研究此信號通路并尋找針對通路中各環(huán)節(jié)的靶向治療對RA有重要意義。

1 TNF-α在RA中的作用

TNF是一種具有廣泛生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，按其結(jié)構(gòu)分2型:TNF-α和 TNF-β，TNF-α由活化的巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，TNF-β由活化的T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生，TNF中發(fā)揮主要生物學(xué)活性的是TNF-α。TNF-α通過細(xì)胞膜上的腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor，TNFR)發(fā)揮生物學(xué)活性，TNFR按相對分子質(zhì)量分為兩類，TNFR1(p55R)和TNFR2(p75R)，它們的胞外區(qū)都含有4個富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域(cysteine-rich-domain，CRD)，每個CRD由6個半胱氨酸組成，形成3對二硫鍵，CRD獨特的結(jié)構(gòu)決定了TNF-α與受體之間的特異性結(jié)合，與TNF-α結(jié)合部位是CRD2和CRD3。TNFR1和TNFR2與各自配體結(jié)合，激活特異信號通路，參與不同的效應(yīng)。TNFR1在細(xì)胞損傷、成纖維細(xì)胞增殖以及細(xì)胞程序性死亡、激活NF-κB等多種生物活性的信號傳遞方面起重要作用;TNFR2通過與TNFR相關(guān)因子(TNFR-associated factor，TRAF)結(jié)合形成復(fù)合體激活NF-κB和JNK激酶，誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄。TNFR1和TNFR2也可共同參與完成某些生物功能。

TNF-α通過抑制骨膠原合成、刺激成纖維細(xì)胞和軟骨細(xì)胞產(chǎn)生前列腺素和膠原酶、刺激軟骨細(xì)胞分泌金屬蛋白酶、升高纖溶酶激活劑的濃度、誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞等途徑，促進軟骨破壞，加重炎性反應(yīng)，進而促進RA的發(fā)生。在RA活動期或進展期，TNF-α呈高水平分泌。研究證實在RA患者外周單核細(xì)胞和關(guān)節(jié)滑膜液的吞噬細(xì)胞能分泌TNF-α，使外周血和關(guān)節(jié)滑液TNF-α增高。李芳等［1］測定RA患者血清TNF-α水平顯著高于正常對照組，且與關(guān)節(jié)疼痛數(shù)、關(guān)節(jié)腫脹數(shù)、紅細(xì)胞沉降率、C反應(yīng)蛋白、類風(fēng)濕因子及血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)正相關(guān)，說明TNF-α與 RA活動度、滑膜炎、血管形成相關(guān)。Izquierdo等［2］比較RA、骨性關(guān)節(jié)炎與正常對照組關(guān)節(jié)鏡下滑膜組織病理提示，RA患者滑膜組織含有大量不成熟的缺乏外周內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋的血管，在RA早期就出現(xiàn)、并與時間、疾病活動性、嚴(yán)重性及細(xì)胞浸潤程度相關(guān)，用TNF-α拮抗劑治療后不成熟血管選擇性耗盡。而骨性關(guān)節(jié)炎患者缺乏這種血管、正常組未發(fā)現(xiàn)這種血管。

TNF-α也可與其他細(xì)胞因子協(xié)同作用促進血管形成，它可上調(diào) VEGF的分泌，使之通過提高血管通透性、促進纖溶酶原激活劑及其蛋白質(zhì)分解酶的釋放、降解毛細(xì)血管基膜、刺激內(nèi)皮細(xì)胞遷移和趨化、誘使匯聚的微血管內(nèi)皮細(xì)胞侵入纖維凝膠并形成管樣結(jié)構(gòu)等途徑促進新生血管的形成，有研究表明膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠的血清 TNF-α含量與滑膜VEGF、滑膜血管增生、新生血管形成相關(guān)［3］。Cha等［4］用 TNF-α 刺激滑膜成纖維細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)，可顯著增加VEGF-mRNA及蛋白表達，并呈劑量依賴性。TNF-α能刺激粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1、IL-6、IL-8的產(chǎn)生，并激活地諾前列酮和膠原酶，引起血管生成;TNF-α與轉(zhuǎn)化生長因子可產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，誘導(dǎo)血管生成［5］;TNF-α 能通過整合素 αvβ3完成對血管新生的作用。這些機制均參與了血管翳的生成。但Hashizume等［6］證實 TNF-α 在體外有抑制血管的作用，可能與 TNF-α在體外發(fā)生生物學(xué)活性的改變有關(guān)。

2 NF-κB通路與RA

NF-κB是由5種亞單位構(gòu)成的同源或異源二聚體蛋白質(zhì)，哺乳動物 NF-κB家族包括 Rel(c-Rel)、RelA(p65)、RelB、NF-κB1(p50)和 NF-κB2(p52)，細(xì)胞中最常見的NF-κB是p65/p50復(fù)合體。所有NF-κB的N末端都含有約300個氨基酸構(gòu)成的Rel同源結(jié)構(gòu)域(RHD)，該區(qū)域參與DNA的結(jié)合及二聚體形成。RHD的C末端含有核定位序列。IκB是NF-κB的抑制蛋白。IκB 蛋白家族包括:IκBα、IκBβ、IκBγ、IκBε、Bcl-3、p105(NF-κB1)、p100(NF-κB2)及 molecule possessing ankyrin-repeats induced by lipopolysaccharide(MAIL，脂多糖誘導(dǎo)性錨蛋白重復(fù)性分子蛋白)。靜息細(xì)胞中NF-κB與IκB蛋白結(jié)合，使NF-κB二聚體與IκB形成的三聚體隱蔽于細(xì)胞質(zhì)。IκB的N端含有Ser磷酸化位點及泛素化位點，在IκB降解時發(fā)揮重要功能;IκB的 C端有 proline，glutamate，serine，and threonine(PEST，脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸)序列，是蛋白酶作用的靶點，與IκB的降解有關(guān)，它在穩(wěn)定IκB分子及抑制NF-κB與DNA結(jié)合中發(fā)揮作用。IKK(IκB kinase)是激活NF-κB經(jīng)典路徑的關(guān)鍵，由IKKα、IKKβ、IKKγ 3個亞基組成，其中IKKα和IKKβ為催化亞基，IKKγ為調(diào)節(jié)亞基。IKKα和IKKβ都含有N端的蛋白激酶結(jié)構(gòu)域和亮氨酸拉鏈形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)域，此區(qū)域中保守位點的磷酸化會導(dǎo)致激酶結(jié)構(gòu)的改變，從而使其獲得活性。

當(dāng)細(xì)胞受到TNF等刺激時，NF-κB經(jīng)典通路激活，在IKK復(fù)合物和E3 IκB-泛素連接酶復(fù)合物作用下，IKKα和IKKβ亞基可特異地將IκBα分子Ser32/Ser36、IκBβ 分 子 的 Ser19/Ser23、IκBγ 分 子 的Ser157/Ser161殘基磷酸化，在26S蛋白酶體系統(tǒng)的作用下，IKB蛋白被降解，暴露核定位序列，導(dǎo)致NF-κB二聚體進入胞核調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。

Woo等［7］證實RA患者滑膜組織可檢測到NF-κB p65和NF-κB p50呈高表達狀態(tài)，表明 NF-κB參與RA病理過程，參與滑膜、血管增生。國內(nèi)外有研究表明腫瘤的血管生成與NF-κB相關(guān)，抑制NF-κB活化可有效抑制腫瘤血管形成［8-9］，而RA血管翳具有類似于腫瘤組織的特性，故抑制NF-κB也可能成為將來控制RA血管形成的有效策略。

3 TNF-α介導(dǎo)的NF-κB通路與RA血管形成的關(guān)系

TNF-α最重要的一個下游信號通路是NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的激活，它已經(jīng)被確認(rèn)參與炎癥、抗凋亡及免疫反應(yīng)。TNF-α激活NF-κB通路有多種信號分子參與，包括 TNFR相關(guān)因子、RIP(receptor interacting protein)、MAP3K(mitogen-activated protein kinase kinase 3)、IKK復(fù)合物等。目前眾多研究多集中在識別該通路的信號元件的組成、翻譯后修改、亞細(xì)胞易位等方面。

3．1 TNF-α激活NF-κB的機制 在細(xì)胞表面，TNFR與其配體相結(jié)合后，可募集TNFR相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域(TNFR-associated death domain，TRADD)，TRADD 可與 TRAF結(jié)合，活化受體相關(guān)蛋白 RIP，RIP與MAP3K相互作用使IKK的磷酸化，在活化的IKK的作用下IκBα被磷酸化，磷酸化的IκBα立即被一個泛素連接酶復(fù)合物SCF/βTrCP識別，然后被26s蛋白酶體識別并迅速降解。IκBα的降解使得核定位序列暴露出來，NF-κB活化而進入細(xì)胞核。發(fā)生核易位后，NF-κB與其目的靶基因的啟動子或增強子上特定的κB系列特異結(jié)合，啟動和調(diào)控RA炎性因子表達，促進滑膜血管翳形成。Calmon-Hamaty等［10］研究表明，RA成纖維細(xì)胞表達 TNF受體Ⅰ、Ⅱ，TNF-α刺激可使NF-κB表達顯著增加。

3．2 TNF-α激活NF-κB促進RA血管形成的途徑

TNF-α激活NF-κB信號通路誘導(dǎo)VEGF、組織因子和細(xì)胞間黏附分子1、血管細(xì)胞黏附分子1、環(huán)氧化酶2的表達，這些分子作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞［11-13］，促進滑膜血管翳的形成。

Cho等［14］研究報道了 CD40L-CD40系統(tǒng)具有與IL-1、TNF不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，兩者結(jié)合后通過激活下游NF-κB基因，最后啟動VEGF基因的表達，為新生血管提供條件。

Scott等［15］的研究表明，TNF-α 能通過激活蛋白1和NF-κB增加RA患者成纖維樣滑膜細(xì)胞中的血管生成素1(angiopoietin-1，Ang-1)mRNA的表達，促進血管發(fā)生、滑膜的增生。此級聯(lián)反應(yīng)可以增強炎性細(xì)胞因子(TNF-α、VEGF、IL-1等)以及基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的表達，從而造成關(guān)節(jié)軟骨的損傷、關(guān)節(jié)破壞。

在FLS 中，NF-κB 活化可以促進IL-1B、IL-6、IL-8、MMPs的產(chǎn)生，促進FLS增生，抑制FLS凋亡，從而出現(xiàn)滑膜血管翳形成，使細(xì)胞釋放更多的細(xì)胞因子和MMPs，增強 IKKβ 的功能，引起 IκB 的降解和 NF-κB核轉(zhuǎn)錄［16-17］。RA患者和正常人的FLS培養(yǎng)結(jié)果顯示，與正常人相比，RA滑膜細(xì)胞增生是通過激活TNFR相關(guān)因子，導(dǎo)致NF-κB活化，并阻礙了RA的FLS正常凋亡，最終使FLS的生長與死亡失衡，造成滑膜細(xì)胞過度增殖，滑膜組織增生［18］。

NF-κB是機體對于TNF-α產(chǎn)生生理性反應(yīng)得到的重要中介物，NF-κB激活后也可以誘導(dǎo)TNF-α的表達、增強TNF-α基因轉(zhuǎn)錄，在某些細(xì)胞和組織中，NF-κB p65、TNF-α 兩者相互促進［19］，形成惡性循環(huán)，加重RA發(fā)展。

4 通過阻斷TNF-α介導(dǎo)的NF-κB信號途徑來治療RA

4．1 阻斷TNF-α TNF-α抑制劑是目前被批準(zhǔn)的用于治療RA的生物制劑，有依那西普(etanercept)、英夫利西單抗(irdliximab)和阿達木單抗(adalimumab)。阻斷TNF-α可有效切斷該通路刺激信號下傳。大量研究表明［20］TNF-α抑制劑可有效改善滑膜缺氧、滑膜炎癥、血管形成。Wright等［21］證實RA患者中性粒細(xì)胞可表達 TNF-α的 mRNA、NF-κB，并顯著高于正常對照組，經(jīng)TNF-α抑制劑治療后TNF-α回到基線水平。

4．2 阻斷NF-κB級聯(lián)反應(yīng)

4．2．1 通過IκB 抑制NF-κB 由于IκB 的N 端含有Ser磷酸化及泛素化位點，在IκB降解發(fā)揮作用，因此，可通過阻斷IκB抑制Ser磷酸化及泛素化位點IκB激活。p65小干擾RNA(p65 siRNA)可以有效地抑制p65的表達，抑制NF-κB的激活，明顯減少TNF-α、IL-1β刺激軟骨細(xì)胞引起的環(huán)氧化酶、一氧化氮合酶、MMP-9 的表達［22］。

4．2．2 蛋白酶體抑制劑 26 S蛋白酶體抑制劑能抑制IκB的降解、NF-κB的核內(nèi)移，有望成為治療RA的新途徑。Iguchi-Hashimoto等［23］證明在RA FLS中，鈣蛋白酶抑制劑可通過穩(wěn)定IκB來抑制NF-κB表達，從而抑制細(xì)胞因子IL-6起到抗炎作用。

4．2．3 通過 IKK 抑制 NF-κB IKK 是 NF-κB 信號通路活化的主要調(diào)節(jié)物，抑制IKK激活來阻止IκB磷酸化從而間接抑制NF-κB信號通路激活。臨床上使用的阿司匹林、布洛芬等非甾體類消炎藥可抑制IKK的活性，阻止 NF-κB途徑的激活。Tsuchiya等［24］用一種新型的IKK抑制劑(CHOP)作用于RA滑膜組織表明，在FLS中，CHOP可抑制TNF-α刺激的炎性因子IL-6、IL-8的表達，減輕RA滑膜炎、血管翳。

4．3 阻斷NF-κB核定位 日本人 Okamoto等［25］證明絲氨酸-蘇氨酸抑制劑法舒地爾可抑制adjuvant-induced arthritis(AIA，佐劑誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎)大鼠FLS細(xì)胞因子和內(nèi)皮細(xì)胞的表達，抑制炎性反應(yīng)和血管形成，阻止關(guān)節(jié)炎發(fā)展，其機制是通過抑制NF-κB與特定DNA序列綁定來發(fā)揮作用，且治療過程中無任何不良反應(yīng)，對RA治療提供有效低毒的策略。

NF-κB誘捕性寡核苷酸是含有NF-κB結(jié)合位點的雙螺旋寡核苷酸，當(dāng) NF-κB 從 NF-κB-IκB 復(fù)合物中解離出來后，NF-κB誘捕性寡核苷酸即可與游離的NF-κB結(jié)合，從而封閉NF-κB，減少炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，減輕炎性反應(yīng)和炎性損傷，在抑制腫瘤血管形成方面已有相關(guān)研究［8-9］，但對RA血管抑制作用尚不明確。

5 小結(jié)

RA早期的病理改變?yōu)槌掷m(xù)性滑膜炎及血管翳的形成，尤其依賴于廣泛新生血管網(wǎng)形成。血管翳具有類似于腫瘤組織的特性——侵蝕性，它可侵蝕和破壞關(guān)節(jié)軟骨和骨組織，最終引起不可逆性的關(guān)節(jié)功能喪失。TNF-α介導(dǎo)的NF-κB通路在RA血管形成中發(fā)揮重要作用，TNF-α抑制劑已應(yīng)用于臨床治療RA，并可有效減少滑膜血管化，但仍有相當(dāng)數(shù)量的患者對此類藥無效。所以，研究TNF-α及下游信號通路NF-κB為靶點，篩選和設(shè)計高效低毒的抗RA新藥是將來研究的重點。

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