腫瘤干細(xì)胞研究：一個(gè)漫長(zhǎng)且不尋常的旅程

河北醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院科研中心 周凱旋 艾軍 單保恩

一直以來(lái)，傳統(tǒng)的腫瘤研究理論把腫瘤看作為一個(gè)均一的細(xì)胞團(tuán)體，并認(rèn)為腫瘤生長(zhǎng)是所有腫瘤細(xì)胞共同增殖的結(jié)果。治療癌癥的傳統(tǒng)方法則是通過(guò)手術(shù)切除、放化療或生物治療等方法盡量去除已經(jīng)存在的腫瘤細(xì)胞，但在常規(guī)治療后癌癥的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移仍是現(xiàn)今需要面對(duì)的嚴(yán)峻問題，使得傳統(tǒng)的腫瘤研究思路似乎也進(jìn)入到了一個(gè)發(fā)展平臺(tái)期。

近年來(lái)的許多研究表明，腫瘤是一個(gè)異質(zhì)性的組織，其生長(zhǎng)是由于組織內(nèi)一小部分具有干細(xì)胞性質(zhì)的腫瘤細(xì)胞增殖分化的結(jié)果。這部分細(xì)胞具有引起腫瘤發(fā)生、維持腫瘤生長(zhǎng)、保持腫瘤異質(zhì)性、甚至具有轉(zhuǎn)移與耐藥的能力，并由此提出了“腫瘤干細(xì)胞(Cancer Stem Cells，CSC)假說(shuō)”。如果傳統(tǒng)治療忽略了這部分細(xì)胞，即使其他大部分腫瘤細(xì)胞都被消滅，但腫瘤仍然會(huì)面臨著復(fù)發(fā)的可能。而近年來(lái)，隨著腫瘤干細(xì)胞假說(shuō)的提出，以及腫瘤干細(xì)胞研究的發(fā)現(xiàn)與興起，使得腫瘤研究進(jìn)入了一個(gè)新的生命時(shí)期。目前，已經(jīng)在白血病、乳腺癌、腦癌等腫瘤組織中成功分離出了腫瘤干細(xì)胞，深入了解這些腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)特性、發(fā)展相應(yīng)的鑒別方法以及特殊的治療手段對(duì)腫瘤研究領(lǐng)域與癌癥的臨床治療都有著極其重要的意義。

1 腫瘤干細(xì)胞的認(rèn)知之路

腫瘤干細(xì)胞的證據(jù)可以追溯到十九世紀(jì)70年代，早在1875年，病理學(xué)家Cohnheim在用顯微鏡對(duì)腫瘤組織和胚胎組織進(jìn)行觀察和比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)兩者很相似，因而認(rèn)為，腫瘤可能來(lái)源于位置錯(cuò)誤的殘余胚胎樣細(xì)胞。到上個(gè)世紀(jì)初，學(xué)者Rotter通過(guò)研究認(rèn)為，在胚胎形成期的原始性細(xì)胞游走至成熟性腺組織以外并突發(fā)性地存留下來(lái)，有可能在日后形成腫瘤”。1956年，Makino等分析了大鼠腹水中腫瘤細(xì)胞的染色體，發(fā)現(xiàn)這些高度變異的染色體有可能來(lái)自同一個(gè)克隆。

人們真正對(duì)腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行深入研究開始于二十世紀(jì)60年代，1963年，Bruce和Van Der Gaag實(shí)驗(yàn)證明脾臟克隆形成技術(shù)可以用來(lái)定量檢測(cè)淋巴瘤細(xì)胞的增殖能力。Kleinsmith和Pierce研究發(fā)現(xiàn)僅僅單獨(dú)一個(gè)胚胎腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的后代包含了14種不同的組織類型，這暗示畸胎瘤起源于一個(gè)多能的惡性干細(xì)胞。其后，Wodinsky等發(fā)現(xiàn)將淋巴細(xì)胞白血病L1210細(xì)胞移植到體內(nèi)，脾臟克隆形成率只有1%～3%。Park和他的同事將小鼠腹水中獲得的不同種骨髓瘤細(xì)胞體外克隆培養(yǎng)，僅有0.01%～1%的腫瘤細(xì)胞可以形成克隆集落，與體內(nèi)進(jìn)行的脾臟克隆形成實(shí)驗(yàn)得到的克隆形成率相一致。1975年，Cairns闡述了三種在自然條件下能延緩組織干細(xì)胞發(fā)生突變的可能存在的機(jī)制，并且提示如果存在一個(gè)早期突變將會(huì)更加有利于克隆形成過(guò)程中的變異。Sell和Pierce[1]在分析前人研究成果之后，認(rèn)為腫瘤細(xì)胞也和正常組織細(xì)胞一樣存在分化、成熟，如果阻斷腫瘤干細(xì)胞的分化將會(huì)影響腫瘤細(xì)胞的增殖并有利于控制腫瘤的生長(zhǎng)和惡化。1997年，Blair[2]等與Bonnet[3]及其同事分別報(bào)道了在急性骨髓性白血病中只有很少的一部分細(xì)胞(0.02%～1%)能夠在NOD/SCID小鼠體內(nèi)形成新的腫瘤。

在前人研究的基礎(chǔ)上，Reya等[4]于2001年提出了“腫瘤干細(xì)胞假說(shuō)”，該假說(shuō)認(rèn)為腫瘤組織是由異質(zhì)性的細(xì)胞群體組成，腫瘤組織中存在的一小部分具有干細(xì)胞性質(zhì)的腫瘤干細(xì)胞具有無(wú)限的自我更新能力，可以產(chǎn)生與上一代完全相同的子代細(xì)胞，并且具有多種分化潛能和高度增殖能力，產(chǎn)生不同表型的腫瘤細(xì)胞，并使腫瘤在體內(nèi)不斷擴(kuò)大，或形成新的腫瘤。

2002年，Clarke的研究小組[5]利用熒光活化細(xì)胞分離技術(shù)(Fluorescence Activated Cell Sorting，F(xiàn)ACS)即流式細(xì)胞術(shù)首次從乳腺癌腫分離出腫瘤干細(xì)胞。2003年Al-Hajj等[6]通過(guò)特異性的細(xì)胞表面標(biāo)志Lin-ESA+CD44+CD24-/low分離純化出乳腺癌干細(xì)胞，這種干細(xì)胞只占有乳腺癌細(xì)胞的2%，但只需要200左右個(gè)細(xì)胞就可在小鼠乳腺中形成腫瘤。此后，研究人員又用不同的細(xì)胞表面分選標(biāo)記分別從腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤[7]、肉瘤[8]、結(jié)腸癌[9-11]、頭頸癌[12,13]、肝癌[14-16]、肺癌[17]、黑素瘤[18]、胰腺癌[19]、前列腺癌[20]中分離出腫瘤干細(xì)胞，這些研究進(jìn)一步支持了腫瘤干細(xì)胞假說(shuō)，也為開拓新一代腫瘤治療方案提供了依據(jù)。

2 腫瘤干細(xì)胞的起源

關(guān)于腫瘤的起源，目前有兩種學(xué)說(shuō)：一是正常干細(xì)胞經(jīng)過(guò)突變形成腫瘤干細(xì)胞，進(jìn)而發(fā)展成為腫瘤；二是一部分組織內(nèi)細(xì)胞在去分化后變?yōu)橛字杉?xì)胞并具有分裂能力。兩種觀點(diǎn)都持有各自的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，但目前腫瘤的干細(xì)胞起源學(xué)說(shuō)得到越來(lái)越多的研究結(jié)果支持。

關(guān)于腫瘤干細(xì)胞的起源，Reya[4]通過(guò)比較造血干細(xì)胞和白血病干細(xì)胞的特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)它們之間有很多相似之處：① 都有自我更新和增殖分化的能力；②存在相似的調(diào)節(jié)自我更新的信號(hào)通路，比如Bmi-1、Wnt、Shh和Notch等[21-23]；③可以分化成各種不同表型的細(xì)胞。因此，認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞很可能是起源于正常的干細(xì)胞，因?yàn)閺母杉?xì)胞突變成腫瘤干細(xì)胞要比從已經(jīng)分化的細(xì)胞重編程為具有自我更新能力的細(xì)胞要來(lái)得簡(jiǎn)單的多。而且另外一個(gè)理由是，腫瘤的產(chǎn)生是多基因突變作用的結(jié)果，由于干細(xì)胞具有自我更新能力，且生存周期較長(zhǎng)，因此，干細(xì)胞發(fā)生多次突變的機(jī)會(huì)遠(yuǎn)比成熟的終末分化細(xì)胞高。在長(zhǎng)期的生存過(guò)程中，干細(xì)胞最有可能累積多種基因突變，發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化而轉(zhuǎn)變成腫瘤干細(xì)胞。

除了正常的干細(xì)胞可以作為腫瘤干細(xì)胞的來(lái)源之外，定向祖細(xì)胞也可以作為腫瘤干細(xì)胞的來(lái)源之一。近年來(lái)的一些研究[24-27]支持了這種推測(cè)，他們的研究表明由于基因易位而產(chǎn)生的一些融合蛋白可以將白血病干細(xì)胞的特征傳遞給定向造血祖細(xì)胞，并且通過(guò)用基因表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，白血病干細(xì)胞的基因表達(dá)譜和定向祖細(xì)胞的基本一致，只有少數(shù)本來(lái)只在造血干細(xì)胞中表達(dá)而在定向祖細(xì)胞中不表達(dá)的基因，在白血病干細(xì)胞中又重新被激活，而這些大部分都是調(diào)控細(xì)胞自我更新能力的基因。

3 腫瘤干細(xì)胞與腫瘤

3.1 白血病

腫瘤干細(xì)胞生物學(xué)特征在造血系統(tǒng)中研究的最早也最深入。大部分腫瘤干細(xì)胞的知識(shí)也都是通過(guò)研究造血干細(xì)胞(Hematopoietic Stem Cells，HSCs)和白血病干細(xì)胞(Leukemia Stem Cells，LSCs)而獲得的。在二十世紀(jì)80年代末90年代初的時(shí)候，人們對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)記譜的了解加深，并將其與流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合起來(lái)，使得快速分離純化干細(xì)胞成為可能，這極大地推動(dòng)了腫瘤干細(xì)胞的研究，為腫瘤干細(xì)胞的存在提供了更直接的證據(jù)[28]。

Dick等[3]利用FACS從急性骨髓性白血病(Acute Myeloid Leukemia，AML)中首次分離出腫瘤干細(xì)胞。他們發(fā)現(xiàn)在AML細(xì)胞中，只有表型為CD34+、CD38-的AML細(xì)胞才能在NOD/SCID(Non-obese Diabetic，Severe-Combined Immunodeficient)小鼠中產(chǎn)生類似人類的急性粒細(xì)胞白血病，而表型為CD34+、CD38+和CD34-的AML細(xì)胞在NOD/SCID小鼠中都不能誘導(dǎo)產(chǎn)生白血病。另外，這種通過(guò)異源移植腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的AML可以繼續(xù)移植到新的小鼠體內(nèi)而誘導(dǎo)產(chǎn)生新的AML，這也從另一個(gè)方面說(shuō)明CD34+、CD38-表型的AML細(xì)胞具有自我更新的能力。有趣的是，白血病干細(xì)胞LSCs的CD34+、CD38-表型和造血干細(xì)胞HSCs的表型一樣，因此，認(rèn)為L(zhǎng)SCs有可能來(lái)源于HSCs。近年來(lái)Krivtsov和Twomey等[24]的研究工作也支持了這種假設(shè)，他們通過(guò)比較LSCs和粒-巨祖細(xì)胞(Granulocyte Macrophage Progenitors，GMPs)的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)兩者之間的基因表達(dá)譜絕大部分都相似，而只有少數(shù)與干細(xì)胞或者自我更新相關(guān)的基因被重新激活。并且他們還認(rèn)為從GMPs轉(zhuǎn)變成LSCs可能是由MLL-AF9融合蛋白引起的，他們通過(guò)在GMPs中表達(dá)MLL-AF9融合蛋白，然后將這些GMPs注入到亞致死劑量照射的小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)能夠在這些小鼠體內(nèi)產(chǎn)生AML，并且只需要4個(gè)產(chǎn)生出的LSCs就可以在受體小鼠中產(chǎn)生新的AML。

此外，Cox等[29]用急性淋巴母細(xì)胞白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia，ALL)標(biāo)本研究，發(fā)現(xiàn)只有CD34+、CD19-或者CD34+、CD10-表型的細(xì)胞才能在動(dòng)物模型中形成腫瘤，同樣提示了急性淋巴母細(xì)胞白血病細(xì)胞可能來(lái)源于造血干細(xì)胞。

3.2 乳腺癌

乳腺癌組織是由異質(zhì)性的乳腺癌細(xì)胞群體組成，其各型細(xì)胞的表面分子標(biāo)記不同，這些表面分子標(biāo)記分別包括CD44、CD24、B38.1及ESA(Epithelial Specific Antigen)，CD24和CD44是黏附分子，而B38.1則被認(rèn)為是乳腺癌和卵巢癌的特異性標(biāo)記。Al-Hajj等[6]利用流式細(xì)胞儀首次將各種表型的乳腺癌細(xì)胞分離出來(lái)，然后把這些細(xì)胞以2、5、8×105的量注入到NOD/SCID小鼠乳房脂肪墊中致瘤，發(fā)現(xiàn)所有的CD44+、B38.1+、CD24-在12周內(nèi)都形成腫瘤。而注入表型為CD44-、B38.1-、CD24+癌細(xì)胞的小鼠都沒有長(zhǎng)瘤。接著將CD44+、CD24-/low Lineage-細(xì)胞和其他Lineage-表型的細(xì)胞注入到小鼠乳房脂肪墊中，發(fā)現(xiàn)5×104個(gè)細(xì)胞能長(zhǎng)出腫瘤，而當(dāng)細(xì)胞移植量為104個(gè)時(shí)卻只有很少的一部分能長(zhǎng)出腫瘤。另外，注入103個(gè)表型為CD44+、CD24-/low Lineage-細(xì)胞在小鼠體內(nèi)致瘤率為100%。其后進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，將CD44+、CD24-/low Lineage-細(xì)胞在小鼠體內(nèi)連續(xù)傳四代，其仍舊具有強(qiáng)致瘤性，并且這種表型的細(xì)胞可以分化產(chǎn)生其他表型的腫瘤細(xì)胞。CD44+、CD24-/low Lineage-乳腺癌細(xì)胞這種特性和干細(xì)胞的性質(zhì)極為相似，故可以認(rèn)為CD44+、CD24-/low Lineage-乳腺癌細(xì)胞為乳腺癌干細(xì)胞。

3.3 神經(jīng)膠質(zhì)瘤

Singh[30]等在2003年從人原發(fā)性腦瘤的不同亞型的腫瘤細(xì)胞中分離純化出腦腫瘤干細(xì)胞(Brain Tumor Stem Cells，BTSCs)，并且這些細(xì)胞有顯著的增殖、分化和自我更新能力。他們分離的這種細(xì)胞亞型表達(dá)細(xì)胞表面標(biāo)記CD133，并且這種CD133+細(xì)胞只占有全部腫瘤細(xì)胞中極少的一部分。CD133+細(xì)胞不表達(dá)分化的神經(jīng)細(xì)胞表面標(biāo)志，CD133+細(xì)胞在體外能分化成其他亞型的腫瘤細(xì)胞，且這些腫瘤細(xì)胞的表型和體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的表型相一致。BTSCs在一定程度上和正常的神經(jīng)干細(xì)胞很相似，它們具有同樣的表型，都表達(dá)CD133和Nestin，并且從不同病人腦瘤中分離出的BTSCs都具有相同的表型，這暗示了BTSCs可能來(lái)源于正常神經(jīng)干細(xì)胞。目前為止，很多不同的研究小組已經(jīng)將從臨床上不同級(jí)別的神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的BTSCs分離鑒定出來(lái)[31-33]。

對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的研究已能足夠確定BTSCs的存在，但是，確切地說(shuō)，神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞研究還有一定的局限性。一個(gè)腫瘤干細(xì)胞不僅僅能誘發(fā)腫瘤，更重要的是，它需要具有產(chǎn)生和分化出與原始腫瘤具有一樣表型的腫瘤的能力。當(dāng)然這樣的研究需要將神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞移植到免疫缺陷小鼠的神經(jīng)發(fā)生區(qū)域，這個(gè)在技術(shù)上本身就具有很大的挑戰(zhàn)性。除此之外，對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的研究也還存在其他的限制因素[34]。

3.4 結(jié)腸癌

Dalerba等[10]和Ricci-Vitiani等[11]在2007年同時(shí)報(bào)道他們已經(jīng)成功地分離并鑒定了富含結(jié)腸癌干細(xì)胞的CD133+表型結(jié)腸癌細(xì)胞亞群。O'Brien研究發(fā)現(xiàn)所有的結(jié)腸癌起始細(xì)胞(Colon Cancer-Initiating Cells，CC-ICs)都是CD133+表型的，有限稀釋分析試驗(yàn)表明5.7×104個(gè)未分選的腫瘤細(xì)胞中含有一個(gè)CC-IC，而在262個(gè)CD133+腫瘤細(xì)胞中就含有一個(gè)CC-IC，說(shuō)明CD133+結(jié)腸癌細(xì)胞中富含CC-ICs量為未分選的腫瘤細(xì)胞的200倍。通過(guò)連續(xù)的小鼠致瘤試驗(yàn)證明CC-ICs具有自我更新能力，并且能分化成其他類型的腫瘤細(xì)胞。Ricci-Vitiani等在用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)CD133+結(jié)腸腫瘤細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)其在體外能以未分化的腫瘤球的形式迅速增殖生長(zhǎng)并持續(xù)一年以上，并且移植后產(chǎn)生的腫瘤與原始腫瘤表型相同。

而Dalerba等[9]則認(rèn)為結(jié)腸癌干細(xì)胞的表型應(yīng)該是EpCAMhigh/CD44+，因?yàn)樵谟械哪[瘤中可能不表達(dá)CD133分子，但卻可以表達(dá)CD44表面分子，這說(shuō)明細(xì)胞表面標(biāo)志為EpCAMhigh/CD44+的結(jié)腸癌細(xì)胞中富含的結(jié)腸癌干細(xì)胞要比CD133+表型的更加全面，并且EpCAMhigh/CD44+表型的細(xì)胞也可以用CD133表面標(biāo)志來(lái)分選CD133+細(xì)胞亞群。另外他們認(rèn)為CD166也可以用來(lái)進(jìn)一步分選出結(jié)腸癌干細(xì)胞。

3.5 肝癌

Suetsugu等[15]首次在肝癌細(xì)胞系Huh-7中分離出CD133+表型的細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)該亞型的細(xì)胞占有Huh-7細(xì)胞系總體的50.8%。RT-PCR結(jié)果表明，Huh-7中CD133+細(xì)胞的甲胎蛋白(AFP)mRNA表達(dá)水平明顯高于Huh-7中CD133-細(xì)胞的甲胎蛋白mRNA表達(dá)水平。在SCID小鼠成瘤試驗(yàn)中，Huh-7的CD133-細(xì)胞不能使小鼠致瘤，而Huh-7的CD133+細(xì)胞能成功致瘤。Yin等[16]在研究肝癌細(xì)胞系SMMC-7721時(shí)，發(fā)現(xiàn)CD133+表型的細(xì)胞只占有細(xì)胞系總數(shù)的0.1%～1%。SMMC-7721中CD133+細(xì)胞具有很強(qiáng)的致瘤性，體外培養(yǎng)的時(shí)候，在軟瓊脂和Matrigel上具有較強(qiáng)的克隆形成能力。體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)1000左右個(gè)CD133+SMMC-7721細(xì)胞足夠在NOD/SCID小鼠中成瘤，而CD133-表型的細(xì)胞則不具有致瘤的能力。另外，他們還發(fā)現(xiàn)CD133+細(xì)胞也同樣存在于原發(fā)肝細(xì)胞癌樣品中，以及肝硬化的組織中，正常肝組織中則不存在CD133+表型的細(xì)胞。這些研究表明肝細(xì)胞癌中的肝癌干細(xì)胞的表型有可能是CD133+，或者是CD133+肝癌細(xì)胞中的一個(gè)亞型。然而，由于肝癌的種類繁多，而且各種肝細(xì)胞的起源也不盡相同，以及肝細(xì)胞所具有的一些特殊性質(zhì)(比如，終末分化的肝細(xì)胞在肝臟損傷的情況下可以重新被激活分裂增殖能力)，是否各種肝癌干細(xì)胞都是同一個(gè)表型，還有待于更多的研究去論證。

3.6 前列腺癌

Collins等[20]從前列腺癌中分離出具有CD44+/α2β1high/CD133+表型的前列腺癌干細(xì)胞，這種細(xì)胞只約占腫瘤細(xì)胞的0.1%，具有很強(qiáng)的自我更新能力，并且可以產(chǎn)生其他各種具有分化標(biāo)志的非致瘤癌細(xì)胞，比如能表達(dá)雄激素受體以及前列腺酸性磷酸酶。他們還從不同級(jí)別的前列腺癌中分離出CD44+/α2β1high/CD133+表型的腫瘤細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)這種前列腺癌干細(xì)胞與前列腺癌的級(jí)別無(wú)關(guān)。

3.7 其他腫瘤組織中的腫瘤干細(xì)胞

目前除了在上述的幾種腫瘤組織中分離出腫瘤干細(xì)胞之外，在其他腫瘤組織中也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)、分離出富含腫瘤干細(xì)胞的細(xì)胞亞群。Gibbs等[8]從骨肉癌中分離出一小亞群腫瘤細(xì)胞，它們具有自我更新能力，并且在無(wú)血清的條件下能形成懸浮的細(xì)胞球，稱為“Sarcospheres”。這些骨肉瘤細(xì)胞能在基因水平表達(dá)STAT3以及多能胚胎干細(xì)胞的標(biāo)志基因Oct3/4和Nanog，但從蛋白水平來(lái)檢測(cè)卻發(fā)現(xiàn)量很少。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，只有表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志Stro-1、CD44和CD105的腫瘤細(xì)胞才能被誘導(dǎo)分化為其他表型的腫瘤細(xì)胞。這表明骨肉瘤干細(xì)胞的表型應(yīng)為Stro-1+/CD105+/CD44+。

Prince等[12]在對(duì)頭頸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，CD44+表型的腫瘤細(xì)胞中存在一小部分細(xì)胞能在小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中生成新的腫瘤。進(jìn)一步分析表明，具有致瘤能力的CD44+細(xì)胞能在RNA和蛋白水平表達(dá)Bmi1基因，而Bmi1基因在干細(xì)胞調(diào)控自我更新中起著重要作用，當(dāng)然Bmi1 也和腫瘤發(fā)生有關(guān)聯(lián)。Chen等[13]將頭頸部鱗癌的發(fā)生與CD133/Src信號(hào)通路的調(diào)控及上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)具有致瘤能力的頭頸部鱗癌細(xì)胞亞群可隨著CD133上調(diào)與EMT效應(yīng)的增強(qiáng)而增多，進(jìn)一步闡明了這種癌癥的發(fā)生機(jī)制。

Fang等[18]研究分析了黑色素瘤干細(xì)胞，他們發(fā)現(xiàn)在分析的樣品中，其中約有20%的黑色素瘤能在人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，并且其中有一小部分細(xì)胞能形成懸浮的細(xì)胞球。而從黑色素瘤細(xì)胞球中分離出來(lái)的細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臈l件下能分化成多種種類的細(xì)胞，如黑色素細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等，這表明這種細(xì)胞又重新獲得了神經(jīng)嵴細(xì)胞的可塑性。在進(jìn)行一系列連續(xù)的體外克隆試驗(yàn)和體內(nèi)移植試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)這種多潛能黑色素瘤球狀細(xì)胞依然能保持這種特性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞都表達(dá)細(xì)胞表面分子CD20，即這些腫瘤發(fā)生細(xì)胞可以用CD20表面分子富集或者說(shuō)黑色素瘤干細(xì)胞的表型為CD20+。

Li等[19]發(fā)現(xiàn)表型為CD44+/CD24+/ESA+的胰腺癌細(xì)胞在免疫缺陷的小鼠中具有高致瘤性，而這種表型的細(xì)胞只占全部胰腺癌細(xì)胞的0.2%～0.8%，有一半的小鼠在注射入100個(gè)CD44+/CD24+/ESA+表型的胰腺癌細(xì)胞都能成功致瘤，并且這種異源移植產(chǎn)生的腫瘤和人體原發(fā)性的胰腺癌在組織學(xué)上都沒有區(qū)別。CD44+/CD24+/ESA+表型的胰腺癌干細(xì)胞和正常干細(xì)胞一樣具有自我更新的能力，且這些細(xì)胞的發(fā)育信號(hào)分子Sonic Hedgehog表達(dá)有所增高。

肺癌中盡管暫時(shí)沒有分離出腫瘤干細(xì)胞，但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ吞崾敬嬖诜伟└杉?xì)胞。Kim等[17]在2005年利用細(xì)胞表面標(biāo)志從大鼠細(xì)支氣管和肺泡管結(jié)合部位分離出表型為Sca-1+/CD45-/PECAM-/CD34+的支氣管肺泡干細(xì)胞(Bronchioalveolar Stem Cells，BASCs)。BASCs能在支氣管或者肺泡損傷時(shí)發(fā)生增殖。BASCs具有明顯的自我更新能力，并且是多潛能細(xì)胞。體外培養(yǎng)時(shí)或者肺癌細(xì)胞前體的K-ras基因的活化能使BASCs增殖。這些都表明BASCs有可能通過(guò)突變而產(chǎn)生腫瘤。具體的肺癌干細(xì)胞的鑒定和純化以及生物學(xué)性質(zhì)還有待于進(jìn)一步的深入研究。

4 腫瘤干細(xì)胞的意義

4.1 腫瘤干細(xì)胞假說(shuō)在臨床治療中的意義

腫瘤干細(xì)胞假說(shuō)的提出對(duì)傳統(tǒng)的腫瘤治療手段發(fā)出了挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的治療腫瘤的方法主要是通過(guò)手術(shù)切除、放化療等方法盡可能多的殺死腫瘤細(xì)胞，以減少腫瘤細(xì)胞數(shù)量來(lái)達(dá)到治療效果。然而，經(jīng)過(guò)臨床治療，大多數(shù)腫瘤患者一段時(shí)間之后又會(huì)復(fù)發(fā)腫瘤，這也是目前腫瘤生物學(xué)研究上一個(gè)很難解決的問題。而按照腫瘤干細(xì)胞假說(shuō)來(lái)看待現(xiàn)在擁有的腫瘤治療方法，就能解釋為什么在腫瘤治療中很多治療方案都不理想。依靠傳統(tǒng)對(duì)待癌癥的治療模式，雖然消滅了大部分的癌細(xì)胞，但是如果占據(jù)總細(xì)胞數(shù)很小比例的腫瘤干細(xì)胞依然存在，即使其他大部分腫瘤細(xì)胞已被消滅，癌癥的復(fù)發(fā)依然會(huì)發(fā)生。因此，徹底地根除癌癥需要首先消滅腫瘤干細(xì)胞。

一些在白血病及實(shí)體瘤中的研究發(fā)現(xiàn)癌癥干細(xì)胞對(duì)目前癌癥常規(guī)的治療手段如化療、放療等都具有耐受性[35-37]，如腫瘤干細(xì)胞內(nèi)活性氧成份偏低，清除自由基的能力更強(qiáng)，成為腫瘤干細(xì)胞對(duì)輻射產(chǎn)生耐受的原因[38]。發(fā)展只針對(duì)腫瘤干細(xì)胞的藥物及治療方法對(duì)癌癥的臨床治療具有重要意義，最近，Gupta等[39]通過(guò)高通量篩選的方法從16000多種化合物中鑒定出了鹽霉素(Salinomycin)具有特異殺傷乳腺癌腫瘤干細(xì)胞的能力，其殺傷數(shù)量是普通抗癌藥物紫杉醇(Paclitaxel)的一百倍。在小鼠模型中還發(fā)現(xiàn)鹽霉素有抑制小鼠乳腺癌腫瘤生長(zhǎng)以及減弱腫瘤細(xì)胞分化的作用。全基因表達(dá)譜分析表明鹽霉素會(huì)引起一些與乳腺癌腫瘤干細(xì)胞相關(guān)基因缺失的表達(dá)。但鹽霉素選擇性殺傷乳腺癌腫瘤干細(xì)胞的機(jī)制還不明了，有待進(jìn)一步研究工作的進(jìn)行。Shipitsin等[40]研究發(fā)現(xiàn)，遺傳基因的改變將會(huì)使一個(gè)正常的細(xì)胞忽視生長(zhǎng)信號(hào)，最終產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞將正常組織破壞。對(duì)腫瘤細(xì)胞的基因?qū)W研究也可以從其他方面解釋人類疾病和很多臨床上不能解釋的現(xiàn)象，所以對(duì)于腫瘤的基因治療也成為了一個(gè)新的研究方向。

盡管腫瘤干細(xì)胞假說(shuō)很具有吸引力，但目前就腫瘤干細(xì)胞這個(gè)細(xì)胞群體在臨床上的重要性仍然不是十分清楚，它們?cè)谂R床上的行為可能很大程度上取決于該群體的數(shù)量與其生物學(xué)特征，而目前對(duì)這方面的研究還有待進(jìn)一步完善[4]。隨著越來(lái)越多的證據(jù)表明腫瘤來(lái)源于腫瘤干細(xì)胞，很多腫瘤研究人員以及臨床研究人員都將研究重點(diǎn)放在腫瘤干細(xì)胞上，而不是整個(gè)腫瘤，這樣將能更快地發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞的性質(zhì)和特點(diǎn)，對(duì)腫瘤臨床診斷與治療策略方面有著很大的指導(dǎo)作用，并為尋找新穎且有效的腫瘤治療方案奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

4.2 腫瘤干細(xì)胞的分離與鑒定

目前分離腫瘤干細(xì)胞主要有3種方法。⑴免疫學(xué)分選法：可分為熒光活化細(xì)胞分選術(shù)(fluorescence activated cell sorting，F(xiàn)ACS) 和免疫磁珠分選術(shù)(magnetic cell sorting，MACS) ，F(xiàn)ACS分選法通過(guò)熒光標(biāo)志的特異性抗體，將表達(dá)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志的細(xì)胞分離出來(lái)，獲得腫瘤干細(xì)胞。⑵懸浮培養(yǎng)分選法：Singh 等首次應(yīng)用此方法得到了表型為 CD133+的腦腫瘤干細(xì)胞克隆形成的神經(jīng)球樣集落，利用此方法培養(yǎng)出的細(xì)胞具有多向分化的潛能，其干細(xì)胞比例可達(dá)4%～20%，適合用于分離表面標(biāo)志物未知腫瘤干細(xì)胞。⑶功能學(xué)分選法，即側(cè)群細(xì)胞分選法。

驅(qū)動(dòng)并維系腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是腫瘤干細(xì)胞最本質(zhì)的特征，因此，腫瘤細(xì)胞動(dòng)物移植實(shí)驗(yàn)是檢驗(yàn)?zāi)[瘤干細(xì)胞的“金標(biāo)準(zhǔn)”。將獲得的腫瘤干細(xì)胞與其他表型細(xì)胞進(jìn)行比較，由于其在NOD/SCID小鼠體內(nèi)有強(qiáng)致瘤性，可將分離出的待測(cè)腫瘤細(xì)胞移植到NOD/SCID小鼠體內(nèi)，進(jìn)而追蹤觀察是否會(huì)有腫瘤生成及腫瘤的發(fā)展進(jìn)程，用以評(píng)估待測(cè)細(xì)胞是否具有形成并維持腫瘤生長(zhǎng)及異質(zhì)性的能力。為了檢測(cè)待測(cè)細(xì)胞是否具有自我更新能力，具有陽(yáng)性標(biāo)記的細(xì)胞將從新生的腫瘤內(nèi)可再次分離出來(lái)并移植到新的NOD/SCID小鼠體內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，形成的移植瘤灶應(yīng)與原發(fā)腫瘤具有相同的形態(tài)學(xué)特征[41]。

除此之外，細(xì)胞表面特異性標(biāo)志是鑒定 CSCs最重要的方法，利用此方法已經(jīng)鑒定出了多種CSCs。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分選(FACS)和磁性激活細(xì)胞分選(Magnetic Activated Cell Sorting，MACS)等方法分選出具有該標(biāo)記的細(xì)胞，再進(jìn)一步通過(guò)干細(xì)胞活性及克隆形成、細(xì)胞增殖與分化等方法檢測(cè)分選出的細(xì)胞是否具有腫瘤干細(xì)胞的潛能[29-31]。目前，世界上已經(jīng)成功地在急性髓性白血病(AML)、B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病(B-Acute Lymphoblastic Leukemia，B-ALL)、原始細(xì)胞危相慢性粒細(xì)胞白血病(Blast-Crisis Chronic Myelocytic Leukemia，Blast-Crisis CML)、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Glioblastoma)、髓母細(xì)胞瘤(Medulloblastoma)、毛細(xì)胞型星型細(xì)胞瘤(Pilocyticastrocytoma)、間變型室管膜瘤(Anaplastic Ependymoma)、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、肝癌、前列腺癌等腫瘤中成功鑒定分離到腫瘤干細(xì)胞的存在[29-34,42]。除表面抗原標(biāo)記物外，研究人員還發(fā)現(xiàn)某些分子標(biāo)記物也可以用來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤干細(xì)胞的鑒定，如乙醛脫氫酶(Aldehyde Dehydrogenase，ALDH)，其活性高低與腫瘤的惡性程度及腫瘤干細(xì)胞的自我更新能力的相關(guān)性已先后在乳腺癌[43]、結(jié)腸癌[44]、肺癌[45]及肝癌[46]中得到證實(shí)。而在Yamashita等[47]發(fā)現(xiàn)的肝癌細(xì)胞中上皮細(xì)胞黏附分子(Epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞群也具備所有腫瘤干細(xì)胞的特性，EpCAM+細(xì)胞較EpCAM-細(xì)胞具有更強(qiáng)的致瘤能力與侵襲性。在膠質(zhì)瘤以及乳腺癌腫瘤細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了腫瘤干細(xì)胞具有26S蛋白酶體活性下降的特性[48]。干細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞可以表達(dá)很多共同的細(xì)胞表面標(biāo)記這一現(xiàn)象，再一次驗(yàn)證了二者的同源性，幾乎相同的調(diào)控因子很可能既調(diào)控著干細(xì)胞同時(shí)又調(diào)控著腫瘤干細(xì)胞的自我更新、分化以及增殖進(jìn)程[49]。另外，腫瘤干細(xì)胞還具有一些其自身特有的細(xì)胞表面抗原標(biāo)記，這些標(biāo)記大多和惡性腫瘤中與致癌、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)相關(guān)的標(biāo)記相似[42,54]，也表明了腫瘤干細(xì)胞與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)具有相關(guān)性[50]。

4.3 腫瘤干細(xì)胞的轉(zhuǎn)移

腫瘤干細(xì)胞不僅和腫瘤的生成密切相關(guān)，而且在腫瘤的整個(gè)發(fā)展進(jìn)程，特別是在腫瘤轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮著重要作用。腫瘤轉(zhuǎn)移，是指癌細(xì)胞從腫瘤的原發(fā)灶遷移到其他的器官和組織中，這是一個(gè)涉及多步驟的復(fù)雜過(guò)程，也是臨床上90%以上癌癥患者死亡的原因。很多學(xué)者認(rèn)為腫瘤處于晚期難以根治的原因在于癌細(xì)胞產(chǎn)生基因突變，導(dǎo)致對(duì)放化療不敏感、患者5年生存率下降。在腫瘤干細(xì)胞假說(shuō)提出后研究人員又提出了轉(zhuǎn)移腫瘤干細(xì)胞假說(shuō)，即在腫瘤干細(xì)胞中存在著一部分具有轉(zhuǎn)移能力的轉(zhuǎn)移腫瘤干細(xì)胞，轉(zhuǎn)移能力的大小與轉(zhuǎn)移腫瘤干細(xì)胞同周圍微環(huán)境之間的關(guān)系有關(guān)[51]。Chen等[52]用造模來(lái)觀察癌細(xì)胞向遠(yuǎn)處的轉(zhuǎn)移，并觀察了這些細(xì)胞的各項(xiàng)參數(shù)。研究結(jié)果表明，這些細(xì)胞需要很強(qiáng)的活動(dòng)力和競(jìng)爭(zhēng)力及轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處后與周圍的正常組織細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)環(huán)境中的養(yǎng)分與生存空間。所以，CSC在向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移過(guò)程中，為了適應(yīng)周圍環(huán)境的需要，需要發(fā)生各種表型的改變，而在其達(dá)到轉(zhuǎn)移目的地后，自身干細(xì)胞特性使其產(chǎn)生優(yōu)勢(shì)克隆，從而導(dǎo)致遠(yuǎn)處惡性腫瘤的發(fā)生。2009年，Thiery等[53]提出了：腫瘤干細(xì)胞的形成、轉(zhuǎn)移甚至耐藥性都與上皮—間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換—EMT及其逆向過(guò)程MET之間存在著密切聯(lián)系，在分子水平上更為詳細(xì)地解釋并支持了轉(zhuǎn)移腫瘤干細(xì)胞的假說(shuō)，預(yù)示著腫瘤干細(xì)胞的分子機(jī)制研究已經(jīng)一步步地從初級(jí)階段開始走向深入。除此之外，腫瘤干細(xì)胞具有更多的遺傳不穩(wěn)定性，也更容易適應(yīng)新環(huán)境存活下來(lái)[54]。

5 展望

對(duì)腫瘤干細(xì)胞的研究已成為當(dāng)前腫瘤研究的熱點(diǎn)，盡管目前我們?cè)谀[瘤干細(xì)胞分離、純化及鑒定上取得了很大的進(jìn)展，但是對(duì)腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)特性、以及它在腫瘤中的分布、數(shù)量都研究和了解得很少，因此，除了繼續(xù)在其他腫瘤組織中分離、鑒定出新的腫瘤干細(xì)胞之外，今后的研究工作重心應(yīng)該集中在研究腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)特征上，了解腫瘤干細(xì)胞較其他腫瘤細(xì)胞所具有的一些特殊信號(hào)調(diào)控路徑，以及其在腫瘤組織中的分布和數(shù)量，這將有助于我們對(duì)腫瘤的診斷和預(yù)后判斷。

隨著對(duì)腫瘤干細(xì)胞研究的深入，以及腫瘤干細(xì)胞假說(shuō)的完善，相信在不久的將來(lái)，人們終究會(huì)探明腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)特性，并利用掌握的這把利劍為治愈腫瘤患者開辟出一條光明大道。

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