2型糖尿病的同型半胱氨酸及胱硫醚β合成酶CBS844ins68基因多態(tài)性特點

羅 丹 鄢盛愷 馬紅雨 程歆琦 宋耀虹

升高的血漿總同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是許多血管性疾病(如冠心病、腦卒中和進(jìn)行性周圍血管病)的獨立危險因素，可用于獨立預(yù)測心腦血管事件發(fā)生的危險性。Hcy是甲硫氨酸轉(zhuǎn)甲基后生成的中間代謝產(chǎn)物，而前者又可在葉酸和VitB12輔助下再甲基化為甲硫氨酸或轉(zhuǎn)硫基生成胱硫醚。由此可知，葉酸和VitB12是Hcy代謝中重要的輔助因子，如果二者攝入不足，可能導(dǎo)致血中Hcy水平升高。除了上述營養(yǎng)因素，Hcy還受遺傳因素的影響，其代謝酶的基因突變引起的缺陷或活性下降也是導(dǎo)致Hcy升高的重要原因。胱硫醚β-合成酶(cystathionineβ-synthase，CBS)是Hcy代謝的關(guān)鍵酶之一。在CBS的催化下，同型半胱氨酸與絲氨酸結(jié)合生成胱硫醚。胱硫醚在γ-胱硫醚合成酶作用下裂解為半胱氨酸和α-酮丁酸。CBS缺乏或活性的降低，可導(dǎo)致Hcy升高。在1995年，Sebastio等發(fā)現(xiàn)一個同型半胱氨酸尿患者的一條等位基因的第8外顯子上發(fā)生了68個堿基的插入，此插入突變復(fù)制了第7內(nèi)含子受體接縫處堿基，可產(chǎn)生兩種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其中一種含有T833C突變和一個提前出現(xiàn)的終止密碼子，該終止子可能導(dǎo)致編碼提前終結(jié)產(chǎn)生無功能的CBS酶［1］。由于不同研究對Hcy、葉酸、VitB12與糖尿病的關(guān)系的結(jié)論不一致，而且CBS844ins68基因多態(tài)性與糖尿病之間關(guān)系的報道也較少且存在很大差異，因此本實驗將對糖尿病患者的Hcy水平及CBS844ins68基因多態(tài)性特點進(jìn)行研究。

對象與方法

1．研究對象:共納入155名無血緣關(guān)系的北方漢族人作為研究對象，其中72例新發(fā)糖尿病患者，選取在最近1年之內(nèi)新近診斷糖尿病的患者，糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn):有典型糖尿病癥狀(多尿、多飲和不能解釋的體重下降)者+隨機(jī)血糖≥11．1mmol/L(200mg/dl)，或 FPG≥7．0mmol/L(126mg/dl)，或0GTT中2hPG≥11．1mmol/L(200mg/dl)。所有糖尿病患者均采用飲食或者藥物控制血糖，未使用胰島素治療，無CHD病史或其他任何疾病，男性34例，女性38例，年齡56．4±5．8歲(DM組);選取83例體檢中心體檢證實的健康正常人作為正常對照組，男性38例，女性45例，年齡56．0±5．8歲。

2．方法:①標(biāo)本采集:禁食12～14h后清晨空腹采肘靜脈血，EDTA K3抗凝血3ml，抽血后立即離心分離，血漿-20℃凍存用于檢測Hcy、葉酸、維生素B12;白細(xì)胞層供提取基因組DNA，用于基因多態(tài)性的檢測;②標(biāo)本的檢測:Hcy測定采用熒光偏振免疫法(fluorescence polarization immunoassay，F(xiàn)PIA)，批號為43352HN00;葉酸、維生素B12測定采用微粒子酶免分析(microparticle enzyme immunoassay，MEIA)，葉酸批號為51253M200，維生素B12批號為52380Q100。三者檢測試劑盒均由雅培公司提供;③CBS844ins68多態(tài)性檢測:采用根據(jù)鄢盛愷等建立的改良NaI法提取基因組DNA。檢測每位受試者的CBS844ins68位點的基因多態(tài)性［2］。下列引物根據(jù)參考文獻(xiàn)設(shè)計，正義鏈:5'-CTG GCC TTG AGC CCT GAA-3';反義鏈:5'-GGC CGG GCT CTG GAC TC-3'［3］。擴(kuò)增體系包括:引物 0．4μmol/L，dNTP200μmol/L，10 × buffer 5μl，MgCl21．0mmol/L，Taq 酶 2．5U，基因組 DNA0．2μg，總體積 50μl。反應(yīng)體系循環(huán)條件為94℃預(yù)變性5min，再進(jìn)行以下循環(huán):94℃1min，58℃ 1min，72℃ 1min，35 循環(huán)次，72℃ 延伸 5min。PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行電泳檢測鑒定。

3．統(tǒng)計學(xué)方法:本研究中Hcy、葉酸、維生素B12為均正偏態(tài)資料，以中位數(shù)表示，經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后均變?yōu)檎龖B(tài)資料，兩組計量資料的統(tǒng)計經(jīng)轉(zhuǎn)換后數(shù)據(jù)采用t檢驗，P值均為對數(shù)轉(zhuǎn)換后的P值。兩組基因型頻率及等位基因頻率比較采用χ2檢驗。以p＜0．05作為差異存在統(tǒng)計學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。采用SPSS 10．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

結(jié) 果

1．糖尿病組與對照組Hcy、葉酸、維生素B12水平的比較:DM組Hcy水平明顯低于對照組(10．9μmol/L vs 12．7μmol/L，P ＜ 0．05)。DM 組葉酸水平明顯高于對照組(8．3ng/ml vs 5．5ng/ml，P ＜0．05)。DM組維生素 B12水平與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(396pg/ml vs 431pg/ml，P ＞0．05)(表1)。

表1 糖尿病組與對照組Hcy、葉酸、維生素B12水平(中位數(shù))的比較

2．CBS844ins68基因型判定:CBS基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物目的長度為184bp。存在CBS844ins68突變者可擴(kuò)增出252bpDNA片段。CBS基因擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

圖1 CBS844ins68擴(kuò)增后不同基因型電泳結(jié)果

3．兩組CBS844ins68基因型及等位基因頻率分布:兩組基因型頻率及等位基因頻率之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均＞0．05)。兩組均未發(fā)現(xiàn)純合突變，且雜合頻率均較低。對照組CBS844ins68雜合頻率6．0%，糖尿病組 1．4%(表 2)。

表2 兩組CBS 844ins68基因型及等位基因頻率的比較

討 論

國內(nèi)外對Hcy與糖尿病之間的關(guān)系報道不完全一致。周靈麗等研究表明糖尿病患者Hcy與正常對照組比較差異無顯著意義，與本研究結(jié)論不一致，可能與病例選取范圍有關(guān)，其研究的糖尿病患者范圍較廣，并沒有具體區(qū)分單純糖尿病組或糖尿病并發(fā)癥組［4］。陳先榮等［5，6］研究表明 2 型糖尿病的患者 Hcy濃度明顯高于對照組，亦與本研究結(jié)論不一致，原因可能在于除了病例選取范圍比較廣，而且患者年齡范圍亦比較廣(49～85歲)，另有研究表明Hcy與年齡具有顯著相關(guān)性，Hcy隨著年齡增加而增加，如果研究中患者年齡偏高也可能導(dǎo)致結(jié)果偏高。黃寧等［7］研究表明糖尿病無并發(fā)癥患者Hcy與正常對照組比較差異無顯著意義，與本研究結(jié)論亦不一致，可能由于其研究中無并發(fā)癥的糖尿病患者的病程較長均超過5年，而本研究均為最近1年之內(nèi)新近診斷糖尿病的患者。Al-Nozah等［8］研究與本研究結(jié)論一致。本研究糖尿病組Hcy水平明顯低于正常對照組，可能由于選取的對象為新發(fā)糖尿病患者，無任何其他疾病或并發(fā)癥。本研究中糖尿病組葉酸水平比正常對照組顯著升高，可能與新發(fā)糖尿病的Hcy減低有關(guān)，前面的研究表明Hcy與葉酸水平顯著負(fù)相關(guān)［6］。

新發(fā)糖尿病Hcy減低的機(jī)制，不是十分清楚，可能與轉(zhuǎn)硫酶活性增強有關(guān)。一研究報道糖尿病鼠的Hcy水平明顯減低，肝臟的轉(zhuǎn)硫酶活性增強，經(jīng)胰島素治療可使酶活性恢復(fù)正常從而調(diào)節(jié)Hcy的代謝［9］;另一項研究報道，糖尿病鼠的Hcy水平也明顯減低，肝臟的甜菜堿-同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(BHMT)和CBS活性及其mRNA均增加［10］。

然而糖尿病隨著病程的增加，Hcy有可能因為腎臟功能損傷而增加。腎臟是Hcy代謝與清除的主要場所，含有Hcy再甲基化和轉(zhuǎn)硫基的多種酶系，約70%的Hcy從腎臟排泄。糖尿病患者隨著年齡增加，腎臟甜菜堿-同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶、胱硫醚合成酶、γ-胱硫醚酶等活性降低，腎小球濾過功能下降，被腎小管重吸收的Hcy在腎實質(zhì)上皮細(xì)胞中的代謝減少，這些均會導(dǎo)致Hcy增加［11］。Hcy水平可能與糖尿病患者腎單位損傷的比例、腎臟損傷的進(jìn)展程度以及胰島素抵抗等各種因素有關(guān)［12］。2型糖尿病患者個體在病程進(jìn)展的不同階段，Hcy水平會發(fā)生變化，可以有不同表現(xiàn)。由此可見，不同的糖尿病研究的Hcy水平的結(jié)論不一致可能與病例選取中是否患有并發(fā)癥、病例的年齡、糖尿病的病程時間長短等因素均有關(guān)。

增加的Hcy可促進(jìn)糖尿病冠心病以及糖尿病微血管病變的發(fā)生，其引起機(jī)體損傷的機(jī)制還不十分清楚，可能與以下因素有關(guān):①氧化應(yīng)激損傷;②誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞增殖;③糖尿病患者的LDL比非糖尿病患者的LDL更易發(fā)生同型半胱氨酸化，引起內(nèi)皮細(xì)胞的毒性作用;④晚期糖基化終產(chǎn)物可能協(xié)同Hcy通過氧化應(yīng)激途徑導(dǎo)致內(nèi)皮損傷，加速動脈粥樣硬化的發(fā)展等［13～18］。

CBS 844ins 68的基因多態(tài)性進(jìn)行分析的基本原理:CBS基因的8號外顯子的一個68bp的插入突變(CBS 844ins 68)導(dǎo)致了CBS基因多態(tài)性的產(chǎn)生，對不同個體的基因進(jìn)行CBS844ins 68基因擴(kuò)增，根據(jù)是否因插入突變從而得到不同長度的擴(kuò)增片段，以此區(qū)分不同的基因型。Sebastio等認(rèn)為此基因多態(tài)性產(chǎn)生了提前終止的密碼子，從而產(chǎn)生無功能的CBS酶［1］。不同的CBS基因型可能導(dǎo)致不同個體CBS的表達(dá)與功能上的差異，從而導(dǎo)致不同的生物學(xué)效應(yīng)，因此此基因型可能作為基因背景，導(dǎo)致不同人群對于疾病具有不同的基因易感性以及不同的臨床特征。

本研究中兩組之間CBS844ins68基因型頻率及等位基因頻率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。兩組雜合頻率均較低，且均未發(fā)現(xiàn)純合突變。Tsai等報道CBS844ins68在美國正常人中雜合子較常見，頻率約為11．7%［3］。國內(nèi)研究結(jié)果顯示正常對照組的CBS844ins68bp雜合子頻率為5．0%，與本研究結(jié)果類似。本研究與國外研究存在差異，可能與地域、遺傳、種族等因素有關(guān)。Sebastio等推測由于CBS844插入產(chǎn)生提前出現(xiàn)的終止密碼子，導(dǎo)致產(chǎn)生縮短的蛋白質(zhì)即無功能的 CBS 酶［1］。而 Tsai等［3］報道CBS844ins68插入并沒有導(dǎo)致同型半胱氨酸血癥。Summers等研究亦表明 CBS844ins68可使 MTHFR 677TT者的Hcy與葉酸水平趨向正常。不同研究對CBS844ins68功能結(jié)論不一致，有待擴(kuò)大樣本量、選取特定人群進(jìn)一步研究證實。

本研究結(jié)果表明新發(fā)2型糖尿病患者Hcy水平可能減低，但也應(yīng)監(jiān)測Hcy水平，防止Hcy可能在不同病程對患者造成的損傷，進(jìn)一步的研究應(yīng)區(qū)分不同病程，不同年齡，根據(jù)不同Hcy水平，進(jìn)行補充葉酸或維生素等試驗，對糖尿病患者進(jìn)行個體化治療，盡量減少高Hcy血癥對糖尿病患者的損傷防止并發(fā)癥的發(fā)生。CBS844ins68基因多態(tài)性可能與中國北方漢族人糖尿病無關(guān)。

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