eIF4E基因下調(diào)對人乳腺癌Bcap37細胞凋亡的影響

林 宇 許惠玉 鄒 宇 崔紅霞 劉吉成

真核細胞翻譯起始因子(eukaryotic translation initiation factor 4E，eIF4E)能夠與真核細胞mRNA5'端帽子結(jié)構(gòu)特異結(jié)合，是蛋白質(zhì)翻譯起始的限速因子。其異常表達可使相關(guān)基因產(chǎn)物隨之上調(diào)，改變細胞表型，誘導細胞轉(zhuǎn)化而發(fā)生癌變［1，2］。在人類多種腫瘤組織(如頭頸鱗癌、白血病、胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌)中都發(fā)現(xiàn)eIF4E的高表達，并且與疾病進展相關(guān)，表明其過度表達能促進細胞惡性轉(zhuǎn)化［3～5］。本實驗采用化學合成eIF4E的特異siRNA，轉(zhuǎn)染人乳腺癌Bcap37細胞，觀察其對細胞凋亡的影響及可能機制。

材料與方法

1．實驗材料:人乳腺癌Bcap37細胞株購自上海中科院細胞庫，ATCC細胞;RPMI1640培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品;吖啶橙(AO)、溴乙錠(EB)、Ac－DEVD－pNA為sigma公司產(chǎn)品;細胞周期檢測試劑盒購自南京凱基生物;RT－PCR試劑盒購于大連寶生物;Lipofectamine 2000美國Invitrogen公司產(chǎn)品;兔抗人eIF4E單克隆抗體、鼠抗人GAPDH多克隆抗體購于Cell Signaling;eIF4E－siRNA由上海吉凱公司設(shè)計合成，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

2．siRNA的轉(zhuǎn)染與篩選:人乳腺癌細胞Bcap37用含10%胎牛血清的PRMI1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞以4×105密度接種于6孔板，細胞融合達50%時進行轉(zhuǎn)染。實驗分為未轉(zhuǎn)染組、陰性對照組(正義鏈:5'－UUCUCCGAACGUGUCACGUtt－3'，反義鏈:5'－ACGUGACACGUUCGGAGAAtt－3')、eIF4E －siRNA －1#(正義鏈:5'－GGAUGGUAUUGAG CCUAUGtt－3'，反義鏈:5'－CAUAGGCUCAAUACCAUCCtt－3')、eIF4E－siRNA －2#(正義鏈:5'－GGACGAUG GCUAAUUACAUtt－3'，反義鏈:5'－AUGUAAUUAGCCAUCGUCCtt－3')、eIF4E －siRNA －3#(正義鏈5'－CCUGAUCUCCAAGUUUGAUtt－3'，反義鏈:5'－AUCAAACUU GGAGAUCAG Ctt－3')。轉(zhuǎn)染步驟按照脂質(zhì)體試劑說明書進行，轉(zhuǎn)染siRNA濃度均為50nmol/L。轉(zhuǎn)染48h后，收獲細胞。

3．RT－PCR法檢測細胞eIF4E mRNA的表達:收集轉(zhuǎn)染48h的細胞，Trizol試劑提取細胞總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的方法反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，以cDNA為模板，引物5'－ACG GAA TCT AAT CAG GAG GT－3'(上游)，5'－TTC CCA CAT AGG CTC AAT A－3'(下游)，用以檢測eIF4E基因mRNA的表達，擴增產(chǎn)物長度246bp。同時設(shè)置GAPDH為內(nèi)參照，其上游引物為5'－GCG CCT GGT CAC CAG GGC TGC TT－3'，下游引物為 5'－TGCCGA AGT GGT CGT GGA TGA CCT－3'，擴增片段長度為 506bp。反應條件為 94℃3min，94℃20s，56℃30s，72℃20s，循環(huán) 34 次，末端延伸 72℃10min。PCR產(chǎn)物上樣于2%瓊脂糖凝膠進行電泳，UV照相和密度掃描。

4．Western blotting法檢測eIF4E蛋白表達:收集轉(zhuǎn)染后細胞，于冰上加入100μl細胞裂解液，孵育20min后4℃，12000g離心20min，收集上清為細胞總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。40μg總蛋白經(jīng)12%SDS－PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2h，加入兔抗人eIF4E單克隆抗體(1∶1000稀釋)、鼠抗人GAPDH多克隆抗體(1∶3000稀釋)4℃過夜，TBST洗膜后加入二抗(山羊抗兔和山羊抗鼠均為1∶2000稀釋)室溫孵育2h，TBST洗膜后，ECL發(fā)光試劑顯色，X線片曝光成像。

5．流式細胞儀檢測細胞周期變化:按照試劑盒說明書嚴格操作，收集轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染siRNA48h的細胞，2000r/min離心5min，收集并調(diào)整細胞濃度為106，加入70%乙醇，4℃固定4h以上，染色前PBS洗去固定液，加入100μl RNaseA 37℃水浴30min，400μl PI 4℃避光染色30min后上機檢測，激發(fā)波長488nm。

6．AO/EB染色法檢測細胞凋亡:細胞接種于24孔板，待細胞50%融合時，轉(zhuǎn)染si－eIF4E 50nmol/L，48h后吸除培養(yǎng)基，每孔加入PBS稀釋的AO(100μg/ml)和EB(100μg/ml)等體積混合的熒光染液200μl。37℃避光染色15min后，PBS洗1次，蓋片封片后熒光顯微鏡觀察照相。

7．caspase－3活性檢測:收集轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染的細胞，按照上述方法提取細胞總蛋白，將樣品蛋白濃度定量為4μg/μl，反應體系含 40μl樣品，10μlAc－DEVD －pNA(20μmol/L)、50μl 2倍反應緩沖液(100mmol/L HEPES，2%甘油，5mmol/L DTT，0．5mmol/L EDTA)，37℃避光孵育 2h 以上，酶標儀檢測405nm出吸光值，吸光值直接反應caspase－3活性。

結(jié) 果

1．篩選eIF4E－siRNA有效干擾序列:采用RTPCR法檢測轉(zhuǎn)染不同的3條 eIF4E－siRNA對Bcap37細胞eIF4E基因mRNA表達水平的影響。如圖1所示，eIF4E－siRNA－3#的抑制作用最明顯，抑制率達70．6%。

圖1 siRNA片段抑制Bcap37細胞eIF4E的mRNA水平表達

Western blotting法檢測eIF4E－siRNA對Bcap37細胞eIF4E蛋白表達的影響。結(jié)果與對mRNA水平表達的作用相符，eIF4E－siRNA－3#的基因沉默效應最強，可達85%(圖2)。因此我們選擇eIF4E－siRNA－3#作為eIF4E功能研究的有效干擾片段，進行后續(xù)試驗研究。

圖2 siRNA片段抑制Bcap37細胞eIF4E的蛋白表達

2．eIF4E－siRNA對Bcap37細胞周期和細胞凋亡的影響:細胞周期可反映細胞的增殖狀態(tài)，所以我們采用流式細胞術(shù)檢測了轉(zhuǎn)染50nmol/L eIF4E－siRNA48h的Bcap37細胞和未轉(zhuǎn)染的Bcap37細胞的細胞周期情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染eIF4E－siRNA的細胞G1期比例由55．3%增加到66%，S期細胞比例減少，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0．05)。提示細胞被阻滯在G1期。

圖3 si－eIF4E對Bcap37細胞周期的影響

吖啶橙(AO)能透過胞膜完整的細胞，嵌入細胞核DNA，使之發(fā)出明亮的綠色熒光。溴乙錠(EB)能透過胞膜受損的細胞，嵌入核DNA，發(fā)橘紅色熒光。凋亡的細胞呈現(xiàn)為染色增強，熒光更為明亮，均勻一致的圓狀或固縮狀、團塊狀結(jié)構(gòu)。在熒光顯微鏡下觀察，正?；罴毎?，核染色質(zhì)著綠色并呈正常結(jié)構(gòu)(圖4A)。轉(zhuǎn)染50nml/Lsi－eIF4E 48h的Bcap37細胞核染色質(zhì)著綠色及橘紅色，呈固縮狀或圓珠狀。表明細胞出現(xiàn)明顯凋亡。

圖4 si－eIF4E對Bcap37細胞的誘導凋亡作用(×200)

3．eIF4E－siRNA對 caspase－3活性的影響:caspase－3是細胞凋亡過程中的一個關(guān)鍵酶。caspase－3活性檢測是基于casepase－3可以催化底物Ac－DEVD－pNA產(chǎn)生黃色的pNA(p－nitroaniline)，pNA在405nm附近有強吸收，因此可以通過測定吸光度來檢測caspase－3的活性。實驗通過轉(zhuǎn)染不同濃度的 eIF4E－siRNA，發(fā)現(xiàn)分別轉(zhuǎn)染20、50、100nmol/L的si－eIF4E，caspase－3活性增強為9．43±2．10、11．3 ±2．32、19．7 ±1．45，與對照組 5．12 ±1.22相比差異顯著(p＜0．05)，見圖5。

圖5 si－eIF4E Bcap37轉(zhuǎn)染si－eIF4E的濃度(nmol/L)細胞caspase－3活性的影響

討 論

真核細胞翻譯起始因子eIF4E與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系日益受到重視，其高表達于多種腫瘤細胞，通過調(diào)控腫瘤相關(guān)基因mRNA的翻譯參與腫瘤發(fā)生發(fā)展。eIF4E的過度表達會導致正常情況下不被翻譯的含有長5'－UTR的mRNA基因產(chǎn)物如血管內(nèi)皮生長因子、細胞周期調(diào)節(jié)蛋白等原癌基因蛋白產(chǎn)物上調(diào)，導致細胞惡性轉(zhuǎn)化和分裂，引起腫瘤發(fā)生［6～8］。研究發(fā)現(xiàn)在人乳腺癌組織中有eIF4E的高表達，乳房良性組織中未見其過度表達。降低乳腺癌細胞中原癌基因eIF4E的表達，癌細胞的生長受到明顯抑制。因此，設(shè)想eIF4E基因可成為腫瘤治療的新靶點。

本實驗針對eIF4E靶基因設(shè)計合成了3條siRNA干擾序列，通過RT－PCR和Western blotting法檢測eIF4E基因的干擾效果，篩選出干擾效果最強的一條序列eIF4E－siRNA－3#，用于后續(xù)試驗研究。通過流式細胞儀與AO/EB染色法分析了轉(zhuǎn)染后細胞周期與凋亡的變化，結(jié)果顯示eIF4E基因干擾后，細胞生長抑制，細胞周期阻滯在G1期，并誘導細胞凋亡。從形態(tài)學上證實了干擾eIF4E基因?qū)cap37凋亡的作用后，我們進一步檢測了干擾eIF4E基因后細胞內(nèi)的caspase－3活性。caspase－3是caspase蛋白酶家族最重要成員之一，是細胞凋亡的執(zhí)行因子，凋亡早期的檢測指標。本實驗通過轉(zhuǎn)染eIF4E基因的干擾siRNA，發(fā)現(xiàn)細胞的caspase－3活性隨著eIF4E基因的干擾強度增大有增加的趨勢。說明eIF4E基因與細胞凋亡的關(guān)系與線粒體信號途徑有關(guān)，但是具體作用機制還有待深入研究。綜上所述，eIF4E－siRNA可有效抑制eIF4E原癌基因的表達，eIF4E分子有望成為乳腺癌基因治療的新靶點。

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