重組人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21降糖作用研究

張 健，李婷婷，唐 祿，田海山，，林灼峰，李海燕，王曉杰，，，李校堃， ，

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生物反應(yīng)器與藥物開(kāi)發(fā)教育部工程研究中心，吉林長(zhǎng)春 130021;2.溫州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，浙江

溫州 325035;3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130021;4.浙江格魯斯特生物科技有限公司，浙江溫州 325000)

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(fibroblast growth factor 21，rhFGF21)是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族中的一員［1］，可與 FGF 受體家族成員中的 1、3、4 結(jié)合［2－3］。大量研究證明rhFGF21是和糖脂代謝有關(guān)的因子，它可以調(diào)控多種內(nèi)分泌功能［4］。rhFGF21能明顯增加鼠3T3-Ll脂肪細(xì)胞及人脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收［5］，但與胰島素的作用機(jī)制不同，細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取作用既不靠增加外源性肝素調(diào)節(jié)也不依賴于胰島素，其降血糖作用緩慢持久，大劑量給藥也不會(huì)引起低血糖反應(yīng)。糖尿病是世界上發(fā)病率最高的疾病，胰島β細(xì)胞功能受損是2型糖尿病發(fā)病的生理基礎(chǔ)之一。研究證明rhFGF21對(duì)于胰島β細(xì)胞具有保護(hù)作用［6］。目前胰島素是治療糖尿病的主要藥物，但是長(zhǎng)期使用胰島素會(huì)產(chǎn)生胰島素抵抗［7－8］和破壞胰島 β細(xì)胞，而 rhFGF21具有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌和保護(hù)胰島β細(xì)胞的功能，長(zhǎng)期給藥能夠降低血液中胰島素的水平，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性，使其有望成為治療2型糖尿病的備選藥物。本研究通過(guò)檢測(cè)rhFGF21在細(xì)胞水平上及動(dòng)物模型中對(duì)葡萄糖吸收和血糖濃度的影響，初步探討rhFGF21對(duì)糖代謝的影響，為研究rhFGF21分子機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品、細(xì)胞系及動(dòng)物模型 重組人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21凍干粉(浙江省生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備);人肝細(xì)胞系(HL-7702);前脂肪細(xì)胞系(3T3-L1);大鼠成肌細(xì)胞(L6細(xì)胞，中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù));ob/ob♂小鼠(南京青紫蘭科技有限公司)

1.1.2 主要試劑及儀器 CO2培養(yǎng)箱(Thermo CELLBB15);胰蛋白酶(Sigma);胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone)、二甲基亞砜 D MSO(GIBCO)，葡萄糖檢測(cè)試劑盒(長(zhǎng)春匯力生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.1.1 HL-7702細(xì)胞培養(yǎng) 用含20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，隔天換液，細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右，用0.25%的胰蛋白酶消化，備用。

1.2.1.2 L6細(xì)胞培養(yǎng)及分化 用完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于12孔板，每孔100 000個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞融合度約70%時(shí)，換含2%胎牛血清的高糖DMEM的分化液，直至長(zhǎng)出肌管，約14 d左右分化為成熟肌纖維。

1.2.1.3 3T3 L1 細(xì)胞培養(yǎng)及分化 用完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基)，在37℃，CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3T3-L1細(xì)胞。2 d換1次細(xì)胞培養(yǎng)液，在融合度達(dá)到80%時(shí)接種于24孔板，每孔5 000個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后換分化液一(5 ml DMEM完全培養(yǎng)基中含有0.5 mmol·L－1IBMX，胰島素10 mg·L－1)，48 h再換分化液二(5 ml DMEM完全培養(yǎng)基中含有胰島素10 mg·L－1)，培養(yǎng)48 h換5 ml DMEM完全培養(yǎng)基，約8～10 d分化為成熟脂肪細(xì)胞。

1.2.2 rhFGF-21誘導(dǎo)HL-7702細(xì)胞葡萄糖吸收影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-7702細(xì)胞接種于24孔板中，每孔為 6 00 μl，3.0× 1 04個(gè)細(xì)胞，于 3 7℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，換含1%胎牛血清的 R PMI 1640培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h，更換為1%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋的濃度為200 mg·L－1的RHFGF21，每孔600 μl，3 個(gè)復(fù)孔，依次 2 倍梯度稀釋，共做7個(gè)稀釋濃度。24 h后用葡萄糖氧化酶(GOD-POD)法檢測(cè)培養(yǎng)液中的葡萄糖含量，以未接種細(xì)胞空白復(fù)孔的葡萄糖均值做參比，測(cè)定各孔葡萄糖含量。根據(jù)公式:葡萄糖吸收增加量=(空白對(duì)照組葡萄糖含量－樣品組葡萄糖含量)/空白對(duì)照組葡萄糖含量×100%。

1.2.3 rhFGF21誘導(dǎo)小鼠3T3-L1細(xì)胞葡萄糖吸收影響 將分化好的脂肪細(xì)胞，用0.5%胎牛血清高糖培養(yǎng)基饑餓24 h，加入梯度濃度的RHFGF21，24、48 h測(cè)定葡萄糖含量。

1.2.4 rhFGF21對(duì)L6肌細(xì)胞葡萄糖吸收的影響12孔板成熟L6肌纖維細(xì)胞以含0.5%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基饑餓24 h，換以含0.5%胎牛血清、含不同rhFGF21濃度的培養(yǎng)液，孵育24 h后，用葡萄糖氧化酶(GOD-POD)法檢測(cè)培養(yǎng)液中的葡萄糖含量，以未接種細(xì)胞空白復(fù)孔的糖含量均值為基礎(chǔ)值，測(cè)定各孔葡萄糖吸收量變化。

1.2.5 rhFGF-21對(duì)ob/ob小鼠血糖的影響ob/ob小鼠普通飼料飼養(yǎng);恒溫，恒濕，明暗周期12 h，自由進(jìn)食飲水;每天上午定時(shí)稱體重及飼料消耗。rhFGF21 用量為 0.6 μg·g－1和 2.5 μg·g－1，取 5 只ob/ob小鼠，皮下注射 rhFGF21(每天 0.6 μg·g－1)連續(xù)7 d，分別在d 0、d 3、d 7給藥后1 h檢測(cè)空腹血糖(生理鹽水組比)。取5只ob/ob小鼠，皮下注射 rhFGF21(每天0.6 μg·g－1)，連續(xù)9 d，末次給藥后1 h開(kāi)始口服糖耐量實(shí)驗(yàn)(空腹2 h，測(cè)0 min血糖，灌胃給予2 mg·g－1的葡萄糖溶液，分別于給予葡萄糖溶液后30、60、120 min檢測(cè)血糖)。取5只ob/ob小鼠，皮下注射 rhFGF21(每天 2.5 μg·g－1)連續(xù)7 d，在d 0、d 3、d 7給藥后1 h檢測(cè)餐后血糖。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 上述細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，取其均值，采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，定量數(shù)據(jù)以±s表示。

2 結(jié)果

2.1 rhFGF21促進(jìn)HL-7702細(xì)胞葡萄糖吸收rhFGF21處理 HL-7702細(xì)胞后，在3.9 mg·L－1～100 mg·L－1間rhFGF21促進(jìn)HL-7702細(xì)胞葡萄糖的吸收且呈現(xiàn)濃度－效應(yīng)關(guān)系，EC50值為18.8 mg·L－1，與對(duì)照組相比差異有顯著性(P＜0.01)(見(jiàn)Fig 1)。

2.2 rhFGF21促進(jìn)3T3-L1細(xì)胞葡萄糖吸收 rh-FGF21作用于脂肪細(xì)胞結(jié)果提示，在12.6 mg·L－1～100 mg·L－1間rhFGF21促進(jìn)分化的3T3-L1細(xì)胞葡萄糖的吸收且呈現(xiàn)濃度－效應(yīng)關(guān)系，EC50值為39.5 mg·L－1，與對(duì)照組相比差異有顯著性(P＜0.05)(見(jiàn) Fig 2)。

Fig 2 Effect of rhFGF21 on glucose uptake in differentiated 3T3-L1 cells

2.3 rhFGF21促進(jìn)L6細(xì)胞葡萄糖吸收 rhFGF21從0.3mg·L－1到 250 mg·L－1可促進(jìn) L6 肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗，EC50值為58.5 mg·L－1，與對(duì)照組相比差異有顯著性(P＜0.05)，呈現(xiàn)濃度－效應(yīng)關(guān)系(見(jiàn)Fig 3)。

2.4 rhFGF-21對(duì)ob/ob♂小鼠空腹血糖的作用rhFGF-21按照每天0.6 μg·g－1的劑量頸部皮下注射連續(xù)7 d，分別在d 0、d 3、d 7給藥后1 h檢測(cè)血糖。如圖顯示，與生理鹽水組比，給FGF-21后3 d、7 d，血糖呈降低趨勢(shì)，但差異未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)Fig 4)。

Fig 3 Effect of rhFGF21 on glucose uptake in L6 cells

Fig 4 Effect of rhFGF21 on fasting blood glucose of ob/ob male mice

2.5 rhFGF-21改善ob/ob♂小鼠糖耐量 皮下注射 rhFGF-21(每天 0.6 μg·g－1)，連續(xù) 9 d，末次給藥后1 h開(kāi)始OGTT。如圖顯示，F(xiàn)GF-21(每天0.6 μg·g－1)對(duì)ob/ob小鼠的糖耐量有一定的改善作用(見(jiàn) Fig 5)。

Fig 5 Effect of rhFGF21 on OGTT blood glucose of ob/ob mice

2.6 rhFGF-21對(duì)ob/ob♂小鼠餐后血糖的作用FGF-21按照每天2.5 mg·g－1的劑量頸部皮下注射連續(xù)7 d，在d 0、d 3、d 7給藥后1 h檢測(cè)餐后血糖。給藥后3 d，血糖有所下降，P=0.051。給藥后7 d，產(chǎn)生明顯的降血糖作用(P＜0.05)，見(jiàn)Fig 6。

Fig 6 Effect of FGF-21(2.5 μg·g －1)on postprandial blood glucose of ob/ob mice

3 討論

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21(rhFGF21)是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族的一個(gè)新成員，最早是從小鼠胚胎中分離出來(lái)的一種可分泌蛋白;成年小鼠rhFGF21的mRNA在肝臟內(nèi)大量表達(dá)，在胸腺中低水平表達(dá)，而在其他組織中尚未發(fā)現(xiàn)。人類的FGF21氨基酸序列與FGF19和FGF23較為相近，其同源性分別為35%和24%。因此，F(xiàn)GF21、FGF19和FGF23被歸類為FGFs家族的一個(gè)亞家族。由于這個(gè)亞家族成員與糖脂代謝有著密切的關(guān)系，所以近年來(lái)在國(guó)際上成為糖尿病和肥胖等代謝疾病研究的熱點(diǎn)基因，其中人們最為關(guān)注FGF21。FGF21與其他FGF家族不同，不與肝素結(jié)合 ，也不會(huì)促進(jìn)細(xì)胞分裂作用。美國(guó)Lilly公司已經(jīng)開(kāi)展FGF21用于糖尿病治療藥物的開(kāi)發(fā)，目前正處在Ⅱ期臨床階段。本課題組利用基因工程分泌表達(dá)技術(shù)已經(jīng)獲得rhFGF21純品，為FGF21新藥研究奠定了良好基礎(chǔ)。

基因工程重組蛋白的生物學(xué)活性是反映藥物質(zhì)量及功效的重要指標(biāo)，因此建立穩(wěn)定、靈敏的活性測(cè)定方法對(duì)于產(chǎn)品的生產(chǎn)及質(zhì)量檢測(cè)具有重要意義，同時(shí)也是指導(dǎo)臨床用藥劑量重要的指標(biāo)。在過(guò)去的實(shí)驗(yàn)報(bào)道中大多數(shù)選擇3T3-L1脂肪細(xì)胞作為檢測(cè)葡萄糖吸收的細(xì)胞模型，該方法需要高糖誘導(dǎo)，低糖分化，將前脂肪細(xì)胞3T3-L1分化成脂肪細(xì)胞，再用rhFGF21刺激3T3-L1細(xì)胞。該方法造膜較難，試驗(yàn)周期長(zhǎng)，結(jié)果重現(xiàn)性較差。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)選用人肝細(xì)胞系(HL-7702);前脂肪細(xì)胞系(3T3-L1);大鼠成肌細(xì)胞(L6細(xì)胞)進(jìn)行葡萄糖吸收試驗(yàn)，旨在確定作為rhFGF21活性檢測(cè)用細(xì)胞株，并進(jìn)一步確證rhFGF21體外降糖［9－10］效果及其作用的靶器官。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明rhFGF21可有效調(diào)控3種細(xì)胞模型的葡萄糖吸收，在肝細(xì)胞模型中，在3.9 mg·L－1～100 mg·L－1之間，rhFGF21促進(jìn)HL-7702細(xì)胞葡萄糖的吸收且呈現(xiàn)濃度－效應(yīng)關(guān)系，與對(duì)照組相比差異有顯著性(P＜0.05);在大鼠成肌細(xì)胞模型中，在0.3 mg·L－1～250 mg·L－1之間，rhFGF21 促進(jìn) L6 肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗，與對(duì)照組相比差異有顯著性(P＜0.05);在脂肪細(xì)胞模型中，在12.6 mg·L－1～100 mg·L－1之間，rhFGF21促進(jìn)分化的3T3-L1細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收［5］且呈現(xiàn)濃度－效應(yīng)關(guān)系，與對(duì)照組相比差異有顯著性(P＜0.05);ob/ob小鼠血糖實(shí)驗(yàn)證明，rhFGF-21可降低ob/ob鼠空腹及餐后血糖，同時(shí)改善葡萄糖耐受量。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，rhFGF21對(duì)肝細(xì)胞，脂肪細(xì)胞，骨骼肌細(xì)胞均具有促進(jìn)葡萄糖吸收的作用，肝細(xì)胞，脂肪細(xì)胞，骨骼肌細(xì)胞是rhFGF21作用的靶器官，同時(shí)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確證了rhFGF21降低血糖，改善葡萄糖耐受量的作用，本實(shí)驗(yàn)對(duì)于開(kāi)展rhFGF21藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)及改善葡萄糖吸收機(jī)制研究起到積極的借鑒作用。

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